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सेलुलर तनाव को दूर करने और प्रगति जारी रखने के लिए कैंसर कोशिकाओं ने विभिन्न तंत्र विकसित किए हैं।प्रोटीन किनसे आर (पीकेआर) और इसके प्रोटीन उत्प्रेरक (पीएसीटी) प्रारंभिक प्रतिक्रियाकर्ता हैं जो विभिन्न तनाव संकेतों की निगरानी करते हैं जिससे कोशिका प्रसार और एपोप्टोसिस का निषेध होता है।हालाँकि, कैंसर कोशिकाओं में PACT-PKR मार्ग का नियमन काफी हद तक अज्ञात रहता है।यहाँ, हमने पाया कि लंबे समय तक गैर-कोडिंग RNA (lncRNA) एस्पार्टिल tRNA सिंथेटेज़ एंटीसेंस RNA 1 (DARS-AS1) सीधे PACT-PKR मार्ग के निषेध में शामिल है और कैंसर कोशिका प्रसार को बढ़ावा देता है।CRISPRi 971 कैंसर से जुड़े lncRNA की बड़े पैमाने पर कार्यात्मक जांच का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि DARS-AS1 महत्वपूर्ण रूप से बढ़े हुए कैंसर सेल प्रसार से जुड़ा था।इसलिए, DARS-AS1 नॉकआउट सेल प्रसार को रोकता है और इन विट्रो में विभिन्न कैंसर सेल लाइनों में कैंसर सेल एपोप्टोसिस को बढ़ावा देता है और विवो में ट्यूमर के विकास को काफी कम करता है।यंत्रवत्, DARS-AS1 सीधे PACT सक्रियण डोमेन से जुड़ता है और PACT-PKR इंटरैक्शन को रोकता है, जिससे PKR सक्रियण, eIF2α फॉस्फोराइलेशन को कम करता है, और एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु को रोकता है।चिकित्सकीय रूप से, DARS-AS1 व्यापक रूप से कई कैंसर में व्यक्त किया जाता है, और इस lncRNA की अधिकता एक खराब रोग का संकेत है।यह अध्ययन DARS-AS1 lncRNA द्वारा PACT-PKR मार्ग के कैंसर-विशिष्ट विनियमन को स्पष्ट करता है और कैंसर के निदान और उपचार के लिए एक और लक्ष्य प्रदान करता है।
तनाव के अनुकूल होने की क्षमता कैंसर कोशिका के अस्तित्व और प्रसार की एक महत्वपूर्ण विशेषता है।कठोर सूक्ष्म वातावरण-पोषक तत्वों की कमी, हाइपोक्सिया, और कम पीएच में कैंसर के शिखर के तेजी से प्रसार और चयापचय हॉलमार्क- जो सेल डेथ सिग्नलिंग मार्ग को ट्रिगर कर सकते हैं।तनाव-संवेदनशील जीन जैसे कि p535, हीट शॉक प्रोटीन 6, 7, KRAS8, 9, और HIF-110, 11, 12, 13 का अपचयन अक्सर कैंसर में देखा जाता है, जिससे एपोप्टोसिस को रोकता है और अस्तित्व को बढ़ावा देता है।
प्रोटीन किनसे आर (पीकेआर) यूकेरियोटिक दीक्षा कारक 2α (eIF2α) का एक महत्वपूर्ण तनाव सेंसर और सबयूनिट किनेज है, जो एक अनुवादक नियामक है जो सेलुलर तनाव को कोशिका मृत्यु से जोड़ता है।पीकेआर को मूल रूप से एक विदेशी डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) का पता लगाने के द्वारा एक एंटीवायरल प्रोटीन के रूप में पहचाना गया था।सक्रियण पर, PKR वायरल और सेलुलर प्रोटीन संश्लेषण को बाधित करने के लिए eIF2α को फास्फोराइलेट करता है14,15,16।PACT (PKR एक्टिवेटर प्रोटीन) की पहचान dsRNA17,18,19,20,21,22,23 की अनुपस्थिति में पहले PKR एक्टिवेटर प्रोटीन के रूप में की गई है।पीकेआर के साथ सीधे संपर्क के माध्यम से, पीएसीटी विभिन्न तनावों (सीरम भुखमरी, पेरोक्साइड या आर्सेनाइट उपचार) को पीकेआर और डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्ग में स्थानांतरित करता है।EIF2α फॉस्फोराइलेशन के अलावा, PACT-मध्यस्थता PKR सक्रियण तनाव प्रतिक्रिया से जुड़ी विभिन्न घटनाओं को ट्रिगर करता है, जिसमें PI3K / Akt24 मार्ग के माध्यम से परिवर्तित रेडॉक्स स्थिति, p5325,26 के माध्यम से डीएनए क्षति की जांच में वृद्धि और NF-κB27,28 प्रतिलेखन को नियंत्रित करता है, 29। तनाव प्रतिक्रिया, प्रसार, एपोप्टोसिस और अन्य प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, पीकेआर और पीएसीटी कई बीमारियों के लिए चिकित्सीय लक्ष्य का वादा कर रहे हैं, विशेष रूप से कैंसर 30,31,32,33।हालांकि, इस फुफ्फुसीय कार्यात्मक और जैविक महत्व के बावजूद, कैंसर कोशिकाओं में पीएसीटी / पीकेआर गतिविधि का नियमन मायावी बना हुआ है।
lncRNAs बिना प्रोटीन-कोडिंग क्षमता वाले 200 न्यूक्लियोटाइड से बड़े ट्रांसक्रिप्ट होते हैं।चूंकि अत्याधुनिक संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण परियोजनाओं ने हजारों lncRNAs की पहचान की है, इसलिए उनके जैविक कार्यों को स्पष्ट करने के लिए 35,36 बहुत प्रयास किए गए हैं।अनुसंधान के एक बढ़ते शरीर ने दिखाया है कि lncRNAs कई जैविक प्रक्रियाओं में शामिल हैं, जिसमें X-गुणसूत्र निष्क्रियता का नियमन 38,39, छाप 40, प्रतिलेखन 41,42, अनुवाद और यहां तक ​​कि कैंसर की वृद्धि 44,45,46,47 शामिल है।इन अध्ययनों ने बताया कि कई lncRNAs PACT/PKR मार्ग में शामिल हैं।ऐसे ही एक अध्ययन से पता चला है कि lncRNA ASPACT ने PACT प्रतिलेखन को बाधित किया और PACT mRNA के परमाणु प्रतिधारण को बढ़ाया।अन्य अध्ययनों से पता चला है कि lncRNA nc886 PKR से जुड़ता है और इसके फॉस्फोराइलेशन को रोकता है।अब तक, PACT की मध्यस्थता वाले PKR सक्रियण को विनियमित करने वाले lncRNA की रिपोर्ट नहीं की गई है।
एस्पार्टिल-टीआरएनए सिंथेटेज़ एंटीसेन्स आरएनए 1 (डीएआरएस-एएस1) की पहचान एक ऑन्कोजेनिक lncRNA51,52,53,54 के रूप में की गई है।MiP-194-5p53, miP-12952 और miP-532-3p51 के नियमन के माध्यम से, DARS-AS1 को क्रमशः क्लियर सेल रीनल सेल कार्सिनोमा, थायरॉयड कार्सिनोमा और नॉन-स्मॉल सेल लंग कार्सिनोमा के विकास को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है।टोंग और उनके सहयोगियों ने यह भी पाया कि DARS-AS1 प्रोटीन 39 (RBM39) RNA- बाइंडिंग मोटिफ की स्थिरता को बनाए रखते हुए मायलोमा प्रगति को बढ़ावा देता है।हालाँकि, इस पर कोई अध्ययन नहीं किया गया है कि क्या यह lncRNA PACT-PKR सक्रियण के नियमन और कैंसर कोशिकाओं की तनाव प्रतिक्रिया में शामिल है।
यहां, हमने CRISPRi सिस्टम का उपयोग करते हुए बड़े पैमाने पर लॉस-ऑफ-फंक्शन स्क्रीन का प्रदर्शन किया और यह निर्धारित किया कि DARS-AS1 lncRNA कई प्रकार की कैंसर कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा देता है।इसके अलावा, हमने एक प्रमुख तंत्र की पहचान की है: DARS-AS1 सीधे PACT से जुड़ता है, PACT और PKR बाइंडिंग को रोकता है, eIF2α के फॉस्फोराइलेशन को रोकता है, एक निचला PKR सब्सट्रेट, और अंततः एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु को रोकता है।अंत में, हमारा काम DARS-AS1 lncRNA को PACT-PKR मार्ग के नियामक और कैंसर के उपचार और रोग के संभावित लक्ष्य के रूप में प्रकट करता है।
व्यापक जीनोमिक प्रोफाइलिंग अध्ययनों ने कैंसर से जुड़े सैकड़ों lncRNAs की पहचान की है।हालाँकि, उनका कार्य काफी हद तक अज्ञात रहता है।कैंसर की प्रगति में शामिल होनहार lncRNA उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए, हमने CRISPRi सिस्टम (चित्र 1a) का उपयोग करके SW620 कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइन में कम प्रसार के लिए एक लॉस-ऑफ-फंक्शन स्क्रीन का प्रदर्शन किया।SW480 और SW620 कोलन कैंसर सेल लाइनों की अनूठी विशेषता यह है कि वे एक ही रोगी में प्राथमिक और द्वितीयक ट्यूमर से प्राप्त होते हैं।यह उन्नत कोलन कैंसर की प्रगति में अनुवांशिक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान तुलना प्रदान करता है।इसलिए, हमने RNA अनुक्रमण का उपयोग करते हुए कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों (SW480 और SW620) के प्रतिलेखों का विश्लेषण किया और प्रकाशित साहित्य से कुछ संभावित कार्यात्मक lncRNAs एकत्र किए।इन परिणामों के आधार पर, हमने एक नकारात्मक नियंत्रण (सप्लीमेंट्री डेटा 1) के लिए 971 कैंसर से जुड़े lncRNAs और 500 अलक्षित sgRNA ओलिगोस को लक्षित करते हुए 7355 sgRNA ओलिगोस युक्त एक पूलेड sgRNA लाइब्रेरी डिज़ाइन की।
CRISPRi प्रणाली का उपयोग करके स्क्रीनिंग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।स्क्रीनिंग के बाद b sgRNA संवर्धन।क्षैतिज बिंदीदार रेखा log2 (गुना परिवर्तन) = ±0.58 का प्रतिनिधित्व करती है।ऊर्ध्वाधर बिंदीदार रेखा p मान = 0.05 इंगित करती है।ब्लैक डॉट्स गैर-लक्षित sgRNA (NC के रूप में नामित) का प्रतिनिधित्व करते हैं।लाल बिंदु sgRNAs हैं जो DARS-AS1 को लक्षित करते हैं।ब्लू डॉट्स sgRNAs हैं जो LINC00205 को लक्षित करते हैं, जो पहले वर्णित ऑन्कोजेनिक lncRNA है।गुना परिवर्तन = (सामान्यीकृत पठन, दिन 17)/(सामान्यीकृत पठन, दिन 0)।c DARS-AS1 sgRNA नॉकडाउन ने कोशिका वृद्धि को रोक दिया।त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रयोगों के ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं।* पी 0.05, ** पी 0.01 दो-पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट।d DARS-AS1 ट्यूमर में अभिव्यक्ति (TCGA डेटासेट)।BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, और COAD के रोगियों से क्रमशः (TCGA डेटासेट) युग्मित सामान्य और ट्यूमर नमूनों में DARS-AS1 की अभिव्यक्ति।पी-मान दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे।
प्लास्मिड के निर्माण और लेंटवायरस की पैकेजिंग के बाद, हमने चार स्वतंत्र संक्रमण प्रयोगों में उपरोक्त पुस्तकालय के साथ dCas9-SW620 कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइन को ट्रांसड्यूस किया।इन संक्रमणों के लिए संक्रमण की बहुलता (MOI) 0.1-0.3 थी, यह दर्शाता है कि प्रत्येक कोशिका को केवल एक sgRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है।इन विट्रो कल्चर के 18 दिनों के बाद, स्क्रीनिंग के बाद लक्ष्य sgRNAs का संवर्धन प्रोफ़ाइल कम या बढ़ गया, जबकि गैर-लक्षित नियंत्रण ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की संख्या प्री-स्क्रीनिंग प्रोफ़ाइल की तुलना में अपेक्षाकृत अपरिवर्तित रही, यह दर्शाता है कि हमारे लक्ष्य में एक अत्यधिक स्क्रीन-विशिष्ट है पुस्तकालय।चावल।1बी और अनुपूरक तालिका 1)। LINC00205, जिसे पहले फेफड़े के कैंसर और यकृत कैंसर की प्रगति को बढ़ावा देने के लिए 58, 59, 60 की सूचना दी गई थी, की जांच की गई (लॉग 2 (गुना परिवर्तन) <−0.58, पी मान <0.05), इस स्क्रीनिंग की विश्वसनीयता की पुष्टि करता है (छवि 1 बी)। LINC00205, जिसे पहले फेफड़े के कैंसर और यकृत कैंसर की प्रगति को बढ़ावा देने के लिए 58, 59, 60 की सूचना दी गई थी, की जांच की गई (लॉग 2 (गुना परिवर्तन) <−0.58, पी मान <0.05), इस स्क्रीनिंग की विश्वसनीयता की पुष्टि करता है (छवि 1 बी)। LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1बी)। LINC00205, जो पहले फेफड़े के कैंसर और यकृत कैंसर की प्रगति को बढ़ावा देने के लिए रिपोर्ट किया गया था, 58,59,60 को बाहर रखा गया था (लॉग 2 (गुना परिवर्तन) <-0.58, पी-मान <0.05), इस स्क्रीनिंग की मजबूती की पुष्टि करता है (चित्र। 1 बी) . LINC00205 58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）<-0.58，p 值<0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）<-0.58，p 值<0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1बी)। LINC00205, पहले फेफड़े और यकृत कैंसर की प्रगति को बढ़ावा देने के लिए 58, 59, 60, को बाहर रखा गया था (लॉग 2 (गुना परिवर्तन) <-0.58, पी-मूल्य <0.05), इस स्क्रीनिंग की मजबूती की पुष्टि करता है (चित्र। 1 बी)।
परीक्षण किए गए सभी lncRNAs में, DARS-AS1 की भी जांच की गई, जिसमें तीन संज्ञानात्मक sgRNA ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स 18 दिनों की संस्कृति के बाद काफी कम हो गए, यह सुझाव देते हुए कि इस lncRNA के नॉकडाउन के परिणामस्वरूप कैंसर प्रसार (छवि 1 बी) कम हो गया।इस परिणाम को कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में एमटीएस विश्लेषण द्वारा समर्थित किया गया था, जिसमें दिखाया गया था कि डीएआरएस-एएस 1 नॉकडाउन कोशिकाओं की वृद्धि दर केवल नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 1 सी) की तुलना में आधी थी और कई अन्य कैंसर प्रकारों की पिछली रिपोर्टों के अनुरूप थी।: क्लियर सेल किडनी कैंसर, थायरॉइड कैंसर और नॉन-स्मॉल सेल लंग कैंसर51,52,53,55।हालांकि, कोलोरेक्टल कैंसर में इसके कार्य और आणविक तंत्र का पता नहीं चला है।इसलिए, हमने आगे के अध्ययन के लिए इस lncRNA को चुना।
रोगियों में DARS-AS1 अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए, हमने कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) परियोजना से 10,327 ट्यूमर के नमूनों का व्यापक विश्लेषण किया।हमारे परिणाम बताते हैं कि DARS-AS1 व्यापक रूप से व्यक्त किया जाता है और विभिन्न प्रकार के ट्यूमर में स्वस्थ कोशिकाओं में महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किया जाता है, जिसमें बृहदान्त्र एडेनोकार्सिनोमा (COAD), रीनल क्लियर सेल कार्सिनोमा (KIRC), और रीनल पैपिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP) शामिल हैं।.बहुत कम (चित्र। 1d और अनुपूरक चित्र। 1a, b)। युग्मित स्वस्थ/ट्यूमर नमूनों के विश्लेषण ने आगे मूत्राशय यूरोटेलियल कार्सिनोमा (बीएलसीए), किडनी रीनल क्लियर सेल कार्सिनोमा (केआईआरसी), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (पीआरएडी), फेफड़े के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एलयूएससी) के ट्यूमर में डीएआरएस-एएस1 की काफी उच्च अभिव्यक्ति की पुष्टि की। , गर्भाशय कॉर्पस एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (यूसीईसी), फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (एलयूएडी), लीवर हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा (एलआईएचसी), किडनी रीनल पैपिलरी सेल कार्सिनोमा (केआईआरपी), और कोलन एडेनोकार्सिनोमा (सीओएडी) (पी वैल्यू <0.05) (चित्र। 1e-m) . युग्मित स्वस्थ/ट्यूमर नमूनों के विश्लेषण ने आगे मूत्राशय यूरोटेलियल कार्सिनोमा (बीएलसीए), किडनी रीनल क्लियर सेल कार्सिनोमा (केआईआरसी), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (पीआरएडी), फेफड़े के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एलयूएससी) के ट्यूमर में डीएआरएस-एएस1 की काफी उच्च अभिव्यक्ति की पुष्टि की। , गर्भाशय कॉर्पस एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (यूसीईसी), फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (एलयूएडी), लीवर हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा (एलआईएचसी), किडनी रीनल पैपिलरी सेल कार्सिनोमा (केआईआरपी), और कोलन एडेनोकार्सिनोमा (सीओएडी) (पी वैल्यू <0.05) (चित्र। 1e-m) .युग्मित स्वस्थ/ट्यूमर नमूनों के विश्लेषण से मूत्राशय के यूरोटेलियल कार्सिनोमा (बीएलसीए), क्लियर सेल रीनल और रीनल सेल कार्सिनोमा (केआईआरसी), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (पीआरएडी), फेफड़े के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एलयूएससी) ट्यूमर में डीएआरएस-एएस1 की उच्च अभिव्यक्ति की भी पुष्टि हुई।, карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– एम) । , कॉर्पस यूटेरी (यूसीईसी) का एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा, फेफड़े का एडेनोकार्सिनोमा (एलयूएडी), लीवर का हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा (एलआईएचसी), किडनी का पैपिलरी सेल कार्सिनोमा (केआईआरपी), और कोलन (सीओएडी) का एडेनोकार्सिनोमा (पी वैल्यू <) 0.05) (चित्र 1e-m)।/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 (BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) UCEC），肺腺癌（LUAD），肝肝细胞癌（LIHC），肾肾乳头状细胞癌（KIRP）和结肠腺癌（COAD）（p值<0.05）（图1e-m）।/肿瘤样本 dars-os1 (प्राड) (lusc) ucel） luad） lihc） kirp） coad） （p 值<0.05）（图1e-m）।स्वस्थ/ट्यूमर युग्मित नमूनों के विश्लेषण ने आगे ब्लैडर यूरोटेलियल कार्सिनोमा (बीएलसीए), क्लियर सेल रीनल सेल कार्सिनोमा (केआईआरसी), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (पीआरएडी), और फेफड़े के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एलयूएससी) ट्यूमर में डीएआरएस-एएस1 की भूमिका का समर्थन किया।экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -एम)। कॉर्पस गर्भाशय कार्सिनोमा (यूसीईसी), फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा (एलयूएडी), हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एलआईएचसी), रीनल पैपिलरी सेल कार्सिनोमा (केआईआरपी), और कोलन एडेनोकार्सिनोमा (सीओएडी) (पी वैल्यू <0.05) (चित्रा 1e-एम) में अभिव्यक्ति।एक साथ लिया गया, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि DARS-AS1 व्यापक रूप से और विभिन्न प्रकार के कैंसर में व्यक्त किया जाता है।
क्योंकि DARS-AS1 और DARS (एंटीसेंस स्ट्रैंड को एन्कोडिंग करने वाला जीन) एक ही प्रमोटर को साझा करते हैं और एक दूसरे के बगल में स्थित होते हैं, हमने विशेष रूप से DARS-AS1 को नॉकडाउन करने के लिए shRNA को डिज़ाइन किया है, लेकिन DARS (सप्लीमेंट्री फ़िगर 2a, b और सप्लीमेंट्री टेबल 2) को नहीं। .SW620 के अलावा, हमने shRNA नॉकडाउन (पूरक तालिका 3) की प्रभावकारिता और कार्य का अध्ययन करने के लिए DARS-AS1 को अत्यधिक व्यक्त करने वाली तीन अन्य सेल लाइनों का भी उपयोग किया।हमारे परिणामों ने संकेत दिया कि विकसित सभी तीन shRNAs ने DARS mRNA (सप्लीमेंट्री अंजीर। 2c-f) की मात्रा पर बहुत कम प्रभाव के साथ कम से कम 80% DARS-AS1 नॉकडाउन दक्षता हासिल की।इसके अलावा, हमने पाया कि इन shRNAs के साथ DARS-AS1 नॉकडाउन ने कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों SW620 (49.7%) और HCT116 (27.7%), स्तन कैंसर सेल लाइन MBA-MD-231 (53.4%) में कोशिका वृद्धि को काफी बाधित किया।) और हेपजी2 हेपेटोमा कोशिका रेखा (92.7% कमी), साथ ही साथ असंबद्ध गोले बनाने की उनकी क्षमता (~ 50.8%, 44.6%, 40.7% और 75.7% प्रति कोशिका रेखा की औसत कमी) (चित्र 2ए,बी)।SW620 में, कॉलोनी गठन परख के परिणामों ने आगे पुष्टि की कि DARS-AS1 shRNA ने लगभग 69.6% (छवि 2c) की औसत कमी के साथ सेल प्रसार को काफी बाधित किया।
SW620, HCT116, MBA-MD-231 और HepG2 कोशिकाओं में सेल प्रसार (ए) और गोलाकार गठन (बी) पर नियंत्रण shRNA और DARS-AS1 shRNA का प्रभाव।c SW620 कोशिकाओं में कॉलोनी गठन पर नियंत्रण shRNA और DARS-AS1 shRNA का प्रभाव।सेल प्रसार (डी), गोलाकार गठन (ई), और SW620 कोशिकाओं के कॉलोनी गठन (एफ) DARS-AS1 से अधिक है।दिखाया गया डेटा तीन प्रयोगों का माध्य ± मानक विचलन है।* पी 0.05, ** पी 0.01, और *** पी 0.001 दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट द्वारा।
हानि-के-कार्य अध्ययनों को पूरक करने के लिए, हमने अगली बार SW620 कोशिकाओं को DARS-AS1 (सप्लीमेंट्री अंजीर। 2g) से अधिक बनाया।DARS-AS1 ओवरएक्प्रेशन ने SW620 कोशिकाओं (चित्र। 2d-f) में सेल की वृद्धि (1.8-गुना), अनियंत्रित गोलाकार गठन (1.4-गुना), और कॉलोनी गठन (3.3-गुना) में काफी वृद्धि की।हमने एक अन्य DARS-AS1 व्यक्त सेल लाइन, A549 का उपयोग करके इस परिणाम की पुष्टि की।DARS-AS1 ओवरएक्प्रेशन के कारण यह बढ़ा हुआ सेल प्रसार आगे A549 कोशिकाओं (सप्लीमेंट्री अंजीर। 2h, i और सप्लीमेंट्री टेबल 3) में देखा गया।एक साथ लिया गया, इन लाभ और हानि अध्ययनों से पता चलता है कि DARS-AS1 इन विट्रो में कैंसर कोशिका प्रसार को बढ़ावा देता है।
अंतर्निहित तंत्र का पता लगाने के लिए जिसके द्वारा DARS-AS1 कोशिका प्रसार को नियंत्रित करता है, हमने इसके संभावित प्रोटीन-बाध्यकारी भागीदारों की पहचान करने के लिए RNA पुल-डाउन विश्लेषण किया।RT-qPCR परिणामों से पता चला है कि DARS-AS1 का लगभग 86.2% SW620 कोशिकाओं (सप्लीमेंट्री अंजीर 3a) के साइटोप्लाज्म में स्थित है।इन विट्रो ट्रांस्क्राइब्ड बायोटिनाइलेटेड DARS-AS1 या स्यूडोआरएनए को तब SW620 सेल lysates के साथ SDS-PAGE पृथक्करण के बाद इनक्यूबेट किया गया था।बाद में चांदी के धुंधलापन से पता चला कि एक अलग बैंड (~ 38 kDa) DARS-AS1 पुल नमूनों में काफी समृद्ध था, लेकिन डमी RNA या मोतियों के नमूनों (चित्र 3a) में नहीं।इस बैंड की पहचान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारा PKR सक्रिय करने वाले प्रोटीन (PACT) के रूप में की गई और SW620, HCT116, और HepG2 सेल लाइनों (चित्र 3a, b) में इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा इसकी पुष्टि की गई।पश्चिमी सोख्ता (WB) द्वारा RNA विश्लेषण का उपयोग करके DARS और संबंधित PACT प्रोटीन - PKR और TRBP - के संवर्धन की भी जांच की गई।परिणामों ने संकेत दिया कि DARS-AS1 RNA और इन तीन प्रोटीनों के बीच कोई सीधा संपर्क नहीं पाया गया (सप्लीमेंट्री अंजीर। 3 बी)।DARS-AS1 और PACT के बीच विशिष्ट अंतःक्रिया की RNA इम्युनोप्रेरीगेशन (RIP) विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई, जिससे पता चला कि DARS-AS1 PACT विरोधी एंटीबॉडी में काफी समृद्ध था, लेकिन अन्य नियंत्रण RNAs (चित्र 3c) नहीं।यह निर्धारित करने के लिए कि क्या DARS-AS1 किसी अन्य सेलुलर घटकों की अनुपस्थिति में PACT के साथ सीधे इंटरैक्ट करता है, शुद्ध PACT का उपयोग करके इन विट्रो बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (BLI) परख किया गया था।बायोटिन-लेबल वाले DARS-AS1 या डमी RNA को स्ट्रेप्टाविडिन (SA) बायोसेंसर पर स्थिर किया गया और फिर 1 μM PACT वाले काइनेटिक बफर में इनक्यूबेट किया गया।विशेष रूप से, PACT DARS-AS1 (KD मान ~ 26.9 nM) के लिए दृढ़ता से बाध्य है, लेकिन RNA (चित्र 3डी) की नकल करने के लिए नहीं।एक साथ लिया गया, ये परिणाम DARS-AS1 और PACT के बीच एक सीधी बातचीत और उच्च आत्मीयता प्रदर्शित करते हैं।
RNA पुल विश्लेषण ने SW620 कोशिकाओं में PACT के साथ परस्पर क्रिया करते हुए DARS-AS1 की पहचान की।ऊपर, संबंधित प्रोटीन का चांदी का धुंधलापन।निचले इम्युनोब्लॉट्स को एंटी-पैक्ट एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शित किया गया था।b RNA पुल-डाउन विश्लेषण HCT116 (शीर्ष) और HepG2 (नीचे) कोशिकाओं में किया गया था।इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा PACT संवर्धन का पता लगाया गया था।संकेतित एंटीबॉडी का उपयोग करके SW620 कोशिकाओं में cRNA इम्यूनोप्रेजर्वेशन (RIP) assays का प्रदर्शन किया गया।d PACT बाइंडिंग कर्व्स टू फुल-लेंथ DARS-AS1 या कंट्रोल RNA को बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (BLI) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था।आरएनए को स्ट्रेप्टाविडिन बायोसेंसर पर स्थिर किया गया था।संघ को मापने के लिए 1 μM PACT का उपयोग किया गया था।ई आरएनए पुल परख बायोटिनाइलेटेड फुल-लेंथ डीएआरएस-एएस 1 या ट्रंकेटेड (टॉप) का उपयोग करके किया गया था।PACT प्राप्त (नीचे) दिखाते हुए इम्युनोब्लॉट।f शुद्ध ध्वजांकित PACT को इन विट्रो RIP परख के लिए बायोटिनाइलेटेड फुल-लेंथ DARS-AS1 या ट्रंकेटेड (जैसा कि e में) के साथ जोड़ा गया था।निकाले गए RNA को RT-qPCR द्वारा सत्यापित किया गया था।जी पीएसीटी के लिए विभिन्न आरएनए अंशों की सापेक्ष आत्मीयता बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री का उपयोग करके प्राप्त की गई थी।विश्लेषण के लिए, 100 एनएम आरएनए और 1 माइक्रोन आरएएसटी का उपयोग किया गया था।h इन विट्रो RIP assays को शुद्ध अक्षुण्ण या काटे गए लेबल PACT का उपयोग करके किया गया था।निकाले गए RNA को RT-qPCR द्वारा सत्यापित किया गया था।i SW620 कोशिकाओं की वृद्धि दर DARS-AS1, PACT, या दोनों से अधिक है।j SW620 कोशिकाओं में पूर्ण-लंबाई या काटे गए DARS-AS1 के ओवरएक्प्रेशन का कोशिका वृद्धि पर अलग-अलग प्रभाव पड़ा।k एपोप्टोसिस का पता एंटी-PARP एंटीबॉडी के साथ इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा लगाया गया था।l DARS-AS1 का नॉकआउट SW620 कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है जैसा कि फ्लो साइटोमेट्री द्वारा दिखाया गया है।दिखाया गया डेटा तीन प्रयोगों का माध्य ± मानक विचलन है। *p 0.05, **p 0.01, ***p 0.001, ****p < 0.001, दो-पूंछ वाले छात्र के t परीक्षण द्वारा। *p 0.05, **p 0.01, ***p 0.001, ****p < 0.001, दो-पूंछ वाले छात्र के t परीक्षण द्वारा। *p 0,05, **p 0,01, ***p 0,001, ****p < 0.0001 о вустороннему критерию тьюдента। *p 0.05, **p 0.01, ***p 0.001, ****p <0.0001 टू-टेल्ड स्टूडेंट के टी-टेस्ट द्वारा। *p 0.05, **p 0.01, ***p 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t *p 0.05, **p 0.01, ***p 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t *p 0,05, **p 0,01, ***p 0,001, ****p <0.0001 о вустороннему критерию тьюдента। *p 0.05, **p 0.01, ***p 0.001, ****p <0.0001 टू-टेल्ड स्टूडेंट के टी-टेस्ट द्वारा।
हमने तब PACT एसोसिएशन (चित्र 3e) के लिए आवश्यक DARS-AS1 क्षेत्र की पहचान करने के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा तीन बायोटिनाइलेटेड DARS-AS1 RNA अंश उत्पन्न किए।आरएनए विश्लेषण के परिणामों से पता चला है कि प्रत्येक टुकड़ा पीएसीटी के साथ बातचीत करने में सक्षम था, लेकिन 3′-टर्मिनल क्षेत्र (384–768 न्यूक्लियोटाइड्स ए 3 लेबल) ने 1-384 से अधिक न्यूक्लियोटाइड को ए 1) (छवि 3e) लेबल दिखाया।इसी तरह के परिणाम पुनः संयोजक PACT (चित्र 3f) का उपयोग करके इन विट्रो RIP परख में देखे गए।इन परिणामों के अनुरूप, BLI का उपयोग करके स्थिर RNA अंशों को PACT से बाँधने के प्रयोगों ने यह भी दिखाया कि PACT का A3 (384–768 nt) (लगभग 94.6 nM का KD मान) के लिए एक उच्च संबंध है, जबकि अन्य क्षेत्रों के साथ लगभग कोई संबंध नहीं है।(अंजीर। 3 डी)।
हमने PACT में संबद्ध बाध्यकारी क्षेत्रों की भी जांच की।PACT में तीन कार्यात्मक डोमेन होते हैं, जिनमें से दो संरक्षित डबल-स्ट्रैंडेड RNA-बाइंडिंग डोमेन (dsRBD) और एक तीसरा डोमेन (नामित D3) है जो प्रोटीन इंटरैक्शन के एक सक्रियकर्ता के रूप में कार्य करता है।प्रत्येक डोमेन की lncRNA बाध्यकारी क्षमता की जांच करने के लिए, हमने तीन म्यूटेशनों को इंजीनियर किया, जिन्होंने तीन डोमेन में से प्रत्येक को हटा दिया और इन विट्रो RIP परख का प्रदर्शन किया।हमारे परिणामों से पता चला है कि PACT के तीसरे डोमेन (D3) को हटाने से अन्य दो उत्परिवर्तन (छवि 3h) की तुलना में DARS-AS1 (0.11 गुना बरकरार PACT की तुलना में) के साथ इसकी बातचीत में काफी कमी आई है, यह दिखाया गया था कि रिलीज D3 ने DARS के साथ बातचीत की।-एसी1.एक साथ लिया गया, ये परिणाम बताते हैं कि DARS-AS1 और PACT के बीच बातचीत मुख्य रूप से DARS-AS1 के 3′ छोर और PACT के D3 डोमेन के माध्यम से हो सकती है।
हमने नोट किया कि DARS-AS1 का PACT अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा और PACT का DARS-AS1 (पूरक चित्र 3c) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।हमने तब सेल के विकास पर PACT नॉकडाउन के प्रभाव की जांच की।DARS-AS1 के विपरीत, PACT के खटखटाने पर सापेक्ष कोशिकाएं 1.5–3 गुना तेजी से बढ़ीं (सप्लीमेंट्री अंजीर। 3d)।कॉलोनी गठन परख के परिणामों ने संकेत दिया कि कोशिकाओं ने PACT (सप्लीमेंट्री अंजीर 3e) के साथ shRNA उपचार के बाद 2-3 गुना कॉलोनियों का गठन किया।यह जांचने के लिए कि क्या DARS-AS1 PACT के माध्यम से सेल प्रसार को नियंत्रित करता है, हमने SW620 कोशिकाओं को PACT, DARS-AS1 या दोनों से अधिक उत्पन्न किया।PACT के ओवरएक्प्रेशन ने कोशिका प्रसार (चित्र 3i) का महत्वपूर्ण निषेध दिखाया।जबकि DARS-AS1 overexpression प्रति se सेल प्रसार को काफी बढ़ावा देता है, DARS-AS1 और PACT से अधिक कोशिकाओं की वृद्धि दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।ये परिणाम बताते हैं कि PACT DARS-AS1 ओवरएक्प्रेशन के कारण बढ़े हुए प्रसार का प्रतिकार कर सकता है।
चूंकि DARS-AS1 के विभिन्न क्षेत्रों में अलग-अलग PACT- बाध्यकारी क्षमताएं हैं, इसलिए हमने DARS-AS1 अंशों के अलग-अलग ओवरएक्प्रेशन द्वारा सेल प्रसार पर उनके सापेक्ष प्रभाव की जांच की।अन्य दो अंशों की तुलना में, DARS-AS1 DARS-AS1 में मुख्य PACT-संबंधित क्षेत्र, 3′ छोर (384–768 nt) पर अतिप्रवाहित था, जिसमें सेल प्रसार (छवि 3j) को प्रोत्साहित करने की उच्चतम क्षमता थी।ये परिणाम DARS-AS1 की बाध्यकारी क्षमता और जैविक कार्य के बीच एक सकारात्मक सहसंबंध का संकेत देते हैं।
PACT को प्रो-एपोप्टोटिक प्रोटीन19 बताया गया है।इसलिए, हमने एपोप्टोसिस पर DARS-AS1 के प्रभाव की जांच की।जैसा कि अपेक्षित था, DARS-AS1 नॉकडाउन ने SW620 कोशिकाओं में PARP दरार को काफी बढ़ा दिया और SW620, HCT116, HepG2 और MBA-MD-231 सेल लाइनों (छवि 3k) में एनेक्सिन V-पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि की।3))।3f-h), यह दर्शाता है कि कैंसर कोशिकाओं में DARS-AS1 का एपोप्टोटिक प्रभाव PACT के एपोप्टोसिस-उत्प्रेरण कार्य के विपरीत है।एक साथ लिया गया, ये परिणाम बताते हैं कि DARS-AS1 ऑन्कोजेनिक फ़ंक्शन का तंत्र PACT फ़ंक्शन के निषेध के माध्यम से हो सकता है।
इसके बाद, हमने DARS-AS1-PACT एसोसिएशन के कार्यात्मक निहितार्थों का पता लगाया।PACT को प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से PKR को सक्रिय करने के लिए सूचित किया गया है, जो बाद में eIF2α फॉस्फोराइलेशन को बढ़ाता है, जिससे ट्रांसलेशनल विलोपन और एपोप्टोसिस होता है।सबसे पहले, हमने जांच की कि क्या DARS-AS1 PACT और PKR के सेलुलर स्थानीयकरण को प्रभावित करता है।कन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से पता चला है कि 0.72 के औसत पियर्सन सहसंबंध गुणांक के साथ SW620 कोशिकाओं में PACT और PKR को अत्यधिक कोलोकलाइज़ किया गया था।इस बीच, DARS-AS1 ओवरएक्प्रेशन ने PACT और PKR सह-स्थानीयकरण (मतलब पियर्सन सहसंबंध गुणांक 0.61) (चित्र 4a) को काफी कम कर दिया।यह जांचने के लिए कि क्या DARS-AS1 PACT-PKR इंटरैक्शन को संशोधित कर सकता है, हमने SW620 सेल लाइसेट्स में एंटी-पैक्ट एंटीबॉडी के साथ एक सह-इम्युनोप्रेजर्वेशन (सह-आईपी) परख किया।PKR को नियंत्रण कोशिकाओं में PACT विरोधी में अत्यधिक समृद्ध किया गया था, जबकि DARS-AS1 (छवि 4b) से अधिक कोशिकाओं से lysates में PKR पुनर्प्राप्ति काफी कम हो गई थी।शुद्ध लेबल वाले PACT और PKR का उपयोग इन विट्रो प्रोटीन बाइंडिंग एसेज़ के लिए किया गया था।तदनुसार, वे जिन्होंने DARS-AS1 प्रदान किया लेकिन कोई नियंत्रण RNA ने दबा हुआ PACT-PKR इंटरैक्शन (चित्र 4c) नहीं दिखाया।सभी परिणामों से पता चला कि DARS-AS1 ने PACT और PKR संचार को बाधित कर दिया।
नियंत्रण कोशिकाओं या DARS-AS1 से अधिक कोशिकाओं में PACT और PKR का सह-स्थानीयकरण, confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा गया था।नाभिक डीएपीआई के साथ दागे गए थे।16 तस्वीरों से सांख्यिकीय परिणाम प्राप्त हुए।b सह-इम्युनोप्रेरीगेशन (सह-आईपी) नियंत्रण SW620 कोशिकाओं या DARS-AS1 को ओवरएक्सप्रेस करने वाली कोशिकाओं के सेल lysates में एंटी-पैक्ट एंटीबॉडी का उपयोग करना।c लेबल PACT, शुद्ध PKR और इन विट्रो में DARS-AS1 या नकली RNA के साथ इन विट्रो प्रोटीन बाइंडिंग विश्लेषण के लिए इनक्यूबेट किया गया था।एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी का इस्तेमाल इम्यूनोप्रेजर्वेशन के लिए किया गया था।d संकेतित एंटीबॉडी के साथ इम्युनोब्लॉट्स SW620 और HCT116 कोशिकाओं में नियंत्रण shRNA या DARS-AS1-shRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए गए, जिसके बाद सीरम भुखमरी हुई।e DARS-AS1 अभिव्यक्ति के स्तर ने सेलुलर संवेदनशीलता को tapsigargin में बदल दिया।SW620 कोशिकाओं को DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ओवरएक्प्रेशन प्लास्मिड या कंट्रोल प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था।कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए टैस्पिगैरिन के साथ इलाज किया गया था और एमटीएस अभिकर्मक का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता निर्धारित की गई थी।f इन विट्रो ट्रांसक्राइब्ड DARS-AS1 या डमी RNA और शुद्ध PACT का उपयोग इन विट्रो एक्टिवेशन परख और इम्युनोब्लॉट डिटेक्शन के लिए किया गया था।g इन एंटीबॉडी का उपयोग करने वाले इम्युनोब्लॉट्स SW620-ctrl कोशिकाओं (बाएं) या PKR म्यूटेंट (दाएं) से अधिक कोशिकाओं पर किए गए थे।इन कोशिकाओं को तब सीरम भुखमरी के बाद नियंत्रण shRNA या DARS-AS1-shRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था।एच फ्लो साइटोमेट्री ने दिखाया कि उत्परिवर्ती पीकेआर की निष्क्रियता ने SW620 कोशिकाओं में DARS-AS1- प्रेरित एपोप्टोसिस के लिए मुआवजा दिया।i संकेतित एंटीबॉडी वाले इम्युनोब्लॉट्स SW620 (बाएं) या HCT116 (दाएं) कोशिकाओं में किए गए थे।नियंत्रण shRNA या DARS-AS1 shRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए गए सेल सीरम से वंचित हैं और 100 nM PKR C16 अवरोधक या DMSO के साथ पूरक हैं।स्केल बार = 5 माइक्रोन।दिखाया गया डेटा तीन प्रयोगों का माध्य ± मानक विचलन है।* पी 0.05 दो-पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट।
आमतौर पर यह माना जाता है कि एक बार PACT PKR17 के साथ इंटरैक्ट करता है, तो Thr451 पर PKR फॉस्फोराइलेशन प्रेरित हो सकता है।हमारे परिणामों ने संकेत दिया कि सीरम भुखमरी (छवि 4 डी और अनुपूरक चित्र 4 ए) के बाद डीएआरएस-एएस 1 नॉकडाउन कोशिकाओं में पीकेआर फॉस्फोराइलेशन का स्तर काफी बढ़ गया था।तदनुसार, हमने पाया कि मुख्य PKR सब्सट्रेट eIF2α का फॉस्फोराइलेशन भी DARS-AS1 shRNA (चित्र। 4d और अनुपूरक चित्र। 4a) द्वारा काफी बढ़ा दिया गया था।टैप्सीगैरगिन एक ईआर स्ट्रेसर है जो ईआर को सीए 2+ रिलीज करने का कारण बनता है।टैस्पिगैरिन के साथ उपचार पीएसीटी की अभिव्यक्ति और सक्रियता को प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया है, जो आगे पीकेआर के साथ बातचीत करता है और सक्रिय करता है, जिससे eIF2α फॉस्फोराइलेशन 18,61 बढ़ाकर एपोप्टोसिस हो जाता है।यहां, हमने यह जांचने के लिए कि क्या DARS-AS1 कोशिकाओं को PACT/PKR मार्ग को बाधित करके तनाव को दूर करने में मदद कर सकता है, PACT/PKR मार्ग के उत्तेजक के रूप में tapsigargin का उपयोग किया।हमने देखा कि DARS-AS1 अभिव्यक्ति का स्तर टैस्पिगैरिन के सेल प्रतिरोध के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है।SW620 कोशिकाएं DARS-AS1 को ओवरएक्सप्रेस करती हैं, जब टैस्पिगैरिन के साथ इलाज किया जाता है, जबकि DARS-AS1 नॉकडाउन वाली कोशिकाएं अधिक संवेदनशील हो जाती हैं (चित्र 4e)।इन परिणामों के अनुरूप, DARS-AS1 overexpression ने tapsigargin- प्रेरित PKR फॉस्फोराइलेशन (सप्लीमेंट्री अंजीर। 4b) को कम कर दिया।इसके विपरीत, tapsigargin उपचार के बाद, PKR और eIF2α को नियंत्रण कोशिकाओं (सप्लीमेंट्री अंजीर। 4b) की तुलना में DARS-AS1 नॉकडाउन कोशिकाओं में काफी हद तक फॉस्फोराइलेट किया गया था।दिलचस्प बात यह है कि tapsigargin ने DARS-AS1 अभिव्यक्ति को खुराक पर निर्भर तरीके से प्रेरित किया, जो DARS-AS1 (सप्लीमेंट्री अंजीर। 4c) के तनाव-विरोधी कार्य का संकेत दे सकता है।इसके अलावा, हमने इन अवलोकनों की पुष्टि करने के लिए इन विट्रो सक्रियण assays में प्रदर्शन किया।संक्षेप में, पीकेआर को एंटी-पीकेआर एंटीबॉडी का उपयोग करके सेल लाइसेट्स से शुद्ध किया गया था, फिर इन विट्रो में संचरित पुनः संयोजक पैक्ट और डीएआरएस-एएस 1 के साथ ऊष्मायन किया गया था।एंजाइमी प्रतिक्रिया के बाद, WB का उपयोग करके फॉस्फो-पीकेआर का पता लगाया गया था।हमारे परिणामों ने संकेत दिया कि पीकेआर फॉस्फोराइलेशन को डीएआरएस-एएस 1 द्वारा काफी बाधित किया गया था, लेकिन आरएनए (चित्रा 4 एफ) को नियंत्रित करने से नहीं।इन विट्रो और इन विवो परिणामों से पता चलता है कि DARS-AS1 PACT की मध्यस्थता वाले PKR सक्रियण को रोकता है।उसी समय, हमने DARS-AS1 (चित्र 4f) की उपस्थिति में PACT पुनर्प्राप्ति में कमी भी देखी।यह परिणाम इन विट्रो प्रोटीन बाइंडिंग परख (चित्र 4c) के परिणामों के अनुरूप है और फिर से PACT-PKR एसोसिएशन के लिए DARS-AS1 के अवरुद्ध कार्य को दिखाता है।
PACT के D3 डोमेन में Ser246 और Ser287 सेलुलर तनाव के तहत PKR सक्रियण के लिए आवश्यक हैं।ऐलेनिन के लिए दो सेरीन अवशेषों के प्रतिस्थापन ने उत्परिवर्ती पीएसीटी (एमयूटीडी) दिया, जिसने तनाव की अनुपस्थिति में पीकेआर को सक्रिय किया, और अलैनिन (म्यूटा) के प्रतिस्थापन ने प्रोटोकॉल को उलट दिया।चूंकि हमने DARS-AS1 के साथ सीधे सहयोग में इस डोमेन के महत्व का प्रदर्शन किया है, इसलिए हमने यह परीक्षण करने के लिए इन दो PACT म्यूटेंट को उत्पन्न किया है कि क्या ये अवशेष DARS-AS1 के साथ बातचीत में भी शामिल हो सकते हैं।दिलचस्प बात यह है कि दोनों म्यूटेंट ने DARS-AS1 (सप्लीमेंट्री अंजीर। 4d) से जुड़ने की क्षमता खो दी, यह सुझाव देते हुए कि DARS-AS1 के साथ कुशल बातचीत के लिए PACT प्रोटीन की पूरी संरचना की आवश्यकता हो सकती है।
इसके अलावा, हमारे परिणाम यह भी बताते हैं कि सेल प्रसार के DARS-AS1-shRNA- प्रेरित निषेध को एक प्रमुख नकारात्मक PACT उत्परिवर्ती (PACTmutA) या एक प्रमुख नकारात्मक PKR उत्परिवर्ती (PKRmut) (अनुपूरक चित्र। 4e) को ओवरएक्सप्रेस करके आंशिक रूप से बहाल किया जा सकता है।प्रमुख-नकारात्मक पीकेआर म्यूटेंट के ओवरएक्प्रेशन ने डीएआरएस-एएस 1 नॉकडाउन के साथ-साथ सीरम से वंचित कोशिकाओं (छवि 4 जी) में ईआईएफ 2α फॉस्फोराइलेशन से प्रेरित पीकेआर फॉस्फोराइलेशन को कम कर दिया।इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि DARS-AS1 नॉकडाउन से प्रेरित एपोप्टोटिक कोशिकाओं का अनुपात भी PKRmut (चित्र। 4h और अनुपूरक चित्र। 4g) से अधिक कोशिकाओं में कम हो गया था।PKR kinase गतिविधि का निषेध भी DARS-AS1 फ़ंक्शन को बाधित करता है, क्योंकि परिणामों से पता चला है कि DARS-AS1 नॉकडाउन ने शायद ही कभी PKR और eIF2α फॉस्फोराइलेशन को ट्रिगर किया जब कोशिकाओं को PKR-विशिष्ट C16 अवरोधक (छवि 4i और अनुपूरक चित्र 4h) के साथ इलाज किया गया था।)एक साथ लिया गया, हमारे परिणाम बताते हैं कि DARS-AS1 PACT की मध्यस्थता वाले PKR सक्रियण को रोककर, कम से कम भाग में, सेल प्रसार को बढ़ावा देता है।
आगे ट्यूमरजेनिसिस में DARS-AS1 की भूमिका का पता लगाने के लिए, हमने एक माउस xenograft मॉडल का उपयोग करके विवो प्रयोगों में प्रदर्शन किया। परिणाम बताते हैं कि DARS-AS1 की दस्तक ने चूहों में ट्यूमर के विकास को नाटकीय रूप से कम कर दिया (p मान <0.0001) (चित्र 5a)। परिणाम बताते हैं कि DARS-AS1 की दस्तक ने चूहों में ट्यूमर के विकास को नाटकीय रूप से कम कर दिया (p मान <0.0001) (चित्र 5a)। езультаты оказывают, то нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5a)। परिणाम बताते हैं कि DARS-AS1 नॉकडाउन चूहों में ट्यूमर के विकास को काफी कम कर देता है (p मान <0.0001) (चित्र 5a)।DARS-AS1 p 值<0.0001）（图5a）。DARS-AS1 p值<0.0001）（图5a）。 езультаты оказали, то нокдаун DARS-AS1 начительно снижает опухоли у мышей (значение р <0,0001)। परिणामों से पता चला कि DARS-AS1 नॉकडाउन ने चूहों में ट्यूमर के विकास को काफी कम कर दिया (p मान <0.0001) (चित्र 5a)।इस प्रकार, DARS-AS1 नॉकडाउन समूह में, माध्य ट्यूमर मात्रा में लगभग 72.9% और माध्य ट्यूमर द्रव्यमान में लगभग 87.8% (चित्र 5b-d) की उल्लेखनीय कमी आई।ये परिणाम दृढ़ता से सुझाव देते हैं कि DARS-AS1 विवो में ट्यूमर के विकास को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ावा दे सकता है।
नग्न चूहों में कोलोरेक्टल ऑन्कोजेनेसिस पर विज्ञापन DARS-AS1 नॉकडाउन का प्रभाव।ग्रोथ कर्व्स (ए), ट्यूमर का आकार (बी), वजन (सी), और ट्यूमर इमेज (डी) दिखाए जाते हैं।त्रुटि पट्टियाँ ± SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। n = 10. ****p < 0.0001, दो-पूंछ वाले छात्र के t परीक्षण द्वारा। n = 10. ****p < 0.0001, दो-पूंछ वाले छात्र के t परीक्षण द्वारा। n = 10. ****p < 0,0001 о вустороннему критерию тьюдента। n = 10. ****p <0.0001 दो-पूंछ वाले छात्र का t-परीक्षण।एन = 10. ****पी <0.0001，通过双尾学生t ****पी <0.0001，通过双尾学生t检验。 ****पी < 0.0001 о вустороннему критерию тьюдента। ****पी <0.0001 दो-पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट।e Kaplan-Meier ने DARS-AS1 अभिव्यक्ति के स्तर और UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM और LGG वाले रोगियों में समग्र अस्तित्व के बीच सहसंबंध का विश्लेषण किया।रोगियों में DARS-AS1 अभिव्यक्ति के उच्च स्तर शीर्ष 50% में थे;रोगियों में DARS-AS1 अभिव्यक्ति का निम्न स्तर 50% से नीचे था।लॉग रैंक परीक्षण का उपयोग करके पी-मान निर्धारित किए गए थे।f प्रस्तावित मॉडल जिसमें DARS-AS1 PACT-PKR मार्ग और ट्यूमर के विकास को नियंत्रित करता है।
DARS-AS1 के नैदानिक ​​प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमने इसकी अभिव्यक्ति और रोगी के जीवित रहने के बीच संबंध की जांच की।टीसीजीए डेटासेट का विश्लेषण करके, हमने पाया कि उच्च डीएआरएस-एएस 1 अभिव्यक्ति यूवेल मेलानोमा (यूवीएम), रीनल क्रोमोफोबिया (केआईसीएच), रीनल पैपिलरी सेल कार्सिनोमा (केआईआरपी), मेसोथेलियोमा (एमईएसओ), मल्टीप्लेक्स से जुड़ी थी।लोअर सर्वाइवल ग्लियोब्लास्टोमा मॉर्फोसिस (GBM) और लो-ग्रेड ब्रेन ग्लियोमा (LGG) (चित्र 5e) वाले रोगियों से महत्वपूर्ण रूप से जुड़ा था।ये परिणाम बताते हैं कि DARS-AS1 क्लिनिकल ट्यूमर की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है और कई कैंसर में संभावित भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर हो सकता है।
इस अध्ययन में, बड़े पैमाने पर CRISPRi कार्यात्मक स्क्रीनिंग का उपयोग करते हुए, हमने निर्धारित किया कि DARS-AS1 lncRNA दो प्रमुख तनाव उत्तरदाताओं, PACT और PKR को विनियमित करके कैंसर कोशिका तनाव पर काबू पाता है।PACT के साथ सीधे बातचीत करके, DARS-AS1 ने PACT की मध्यस्थता वाले PKR सक्रियण को रोक दिया, जिससे एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु को रोका जा सके और कोशिका प्रसार (छवि 5f) को बढ़ावा दिया जा सके।DARS-AS1 के अपग्रेडेशन को कई प्रकार के कैंसर में देखा गया है, यह सुझाव देता है कि तनावपूर्ण परिस्थितियों में कैंसर सेल के अस्तित्व को बढ़ावा देने का इसका कार्य मोटे तौर पर कई प्रकार के कैंसर पर लागू हो सकता है।
PACT की पहचान PKR उत्प्रेरक प्रोटीन के रूप में की गई है, और PACT की मध्यस्थता वाले PKR सक्रियण प्रतिलेखन, अनुवाद, एपोप्टोसिस और अन्य महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करके तनाव प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।दशकों से, PACT-PKR कैस्केड के कैंसर-विशिष्ट विनियमन को समझने का प्रयास किया गया है।यहां, हमारे अध्ययन ने सेलुलर lncRNA DARS-AS1 के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं में PACT-PKR के नियमन के एक अलग तंत्र का खुलासा किया, जो सीधे PACT से जुड़ता है, PACT-PKR इंटरैक्शन को रोकता है, PKR सक्रियण और eIF2α फॉस्फोराइलेशन को रोकता है, जिससे तनाव-प्रेरित एपोप्टोसिस को रोकता है और अंतिम कैंसर प्रसार को उत्तेजित करना।कोशिकाएं।यह खोज कैंसर के निदान और उपचार के लिए संभावित lncRNA लक्ष्यों पर प्रकाश डालती है।
हमारे डेटा से पता चला है कि DARS-AS1 नॉकडाउन फॉस्फोराइलेटेड PKR और eIF2α में उल्लेखनीय वृद्धि के साथ सीरम भुखमरी के लिए कोशिकाओं को संवेदनशील बनाता है।ये परिणाम बताते हैं कि DARS-AS1 PACT/PKR गतिविधि को रोककर कठोर परिस्थितियों में कैंसर कोशिका के अस्तित्व को बढ़ावा देता है।कई अन्य गैर-कोडिंग RNAs, जैसे ASPACT और nc886, PACT48 mRNA को डाउनरेगुलेट करके या PKR49,50,64 से बाइंड करके ऑटोफॉस्फोराइलेशन को विनियमित करके PACT/PKR अक्ष में शामिल हैं।उनमें से, DARS-AS1 PACT-PKR एसोसिएशन के विघटनकारी के रूप में कार्य करता है।यह अध्ययन PACT/PKR अक्ष विनियमन और तनाव प्रतिक्रियाओं में lncRNAs की भूमिका के बारे में हमारी समझ को समृद्ध करता है।
PACT में तीन अलग-अलग डोमेन हैं।पहले दो डीएसआरबीडी में से प्रत्येक पीकेआर के लिए पीएसीटी के उच्च आत्मीयता बंधन को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है, जबकि तीसरे डोमेन (डी 3) इन विट्रो और विवो में पीकेआर सक्रियण के लिए आवश्यक है।हमारे अध्ययन से पता चला है कि DARS-AS1 अधिमानतः D3 डोमेन (छवि 3h) के साथ इंटरैक्ट करता है।lncRNA (768 न्यूक्लियोटाइड्स) के बड़े आकार को देखते हुए, DARS-AS1 को D3 से बांधना, dsRBD और PKR के PACT डोमेन के बीच बातचीत को शारीरिक रूप से बाधित कर सकता है, जिससे PACT और PKR का जुड़ाव अवरुद्ध हो जाता है।PACT बिंदु उत्परिवर्तन जिसने D3 में Ser246 और Ser287 को एलेनिन या एस्पार्टेट से बदल दिया, ने DARS-AS1 के लिए इसकी बाध्यकारी आत्मीयता को बाधित कर दिया, जो उनके संघ में D3 के समग्र संरचनात्मक और विद्युत गुणों के महत्व को इंगित करता है।भविष्य में अधिक सटीक जैव रासायनिक विश्लेषण और उच्च संकल्प पैक्ट संरचनात्मक विश्लेषण का उपयोग करके इस तंत्र के और विवरण की आवश्यकता होगी।
पिछले अध्ययनों ने बताया है कि DARS-AS1 कई तंत्रों माध्यम से सेल प्रसार को बढ़ावा देता है।एक उदाहरण में, जांचकर्ताओं ने देखा कि DARS-AS1 ने गुर्दे के कैंसर कोशिकाओं में miP-194-5p को लक्षित करके अपने एंटीसेंस प्रोटीन-एन्कोडिंग DARS जीन को अपग्रेड किया।हालाँकि, वर्तमान अध्ययन में, DARS-AS1 नॉकडाउन का कई प्रकार के कैंसर में DARS प्रतिलेखन पर बहुत कम प्रभाव पड़ा, जिसमें कम से कम कोलोरेक्टल, स्तन और यकृत कैंसर शामिल हैं।क्योंकि lncRNAs सेल- और ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित करते हैं, कार्यात्मक तंत्रों को कैंसर के प्रकारों में संरक्षित नहीं किया जा सकता है, जो हमारी टिप्पणियों और विभिन्न कैंसर के पिछले आकलन के बीच इस विसंगति में योगदान कर सकते हैं।विभिन्न शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं के विशिष्ट तंत्र को स्पष्ट करने के लिए विशेष अध्ययन की आवश्यकता है।
नैदानिक ​​​​आंकड़ों के विश्लेषण से पता चला है कि ट्यूमर में DARS-AS1 अभिव्यक्ति कैंसर रोगियों के अस्तित्व के साथ विपरीत रूप से सहसंबद्ध है, जो कैंसर रोग के निदान में DARS-AS1 / PACT / PKR अक्ष के महत्व को रेखांकित करता है।निष्कर्ष में, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि DARS-AS1 PACT / PKR सिग्नलिंग अक्ष का एक नियामक है, कैंसर कोशिका प्रसार को बढ़ावा देता है, और तनाव प्रतिक्रिया के दौरान एपोप्टोसिस को रोकता है, जो अनुसंधान की एक और पंक्ति प्रदान करता है और संभावित उपचारों में भविष्य के अनुसंधान के लिए रुचि रखता है। .
मानव सेल लाइन SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 और HEK293T चीन में नेशनल सेल लाइन रिसोर्स इंफ्रास्ट्रक्चर से प्राप्त किए गए थे।सभी कोशिकाओं को DMEM माध्यम (DMEM, थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, MA) में 10% FBS (मिथुन, ब्रुकलिन, NY) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ 37 ° C, 5% CO2 के पूरक में बनाए रखा गया था।इनक्यूबेटर
एंटी-पैक्ट, एबकैम (ab31967);एंटी-पीकेआर, एबकैम (ab184257);एंटी-पीकेआर (फॉस्फो-टी451), एबकैम (एबी81303);विरोधी झंडा, Abcam (ab125243);विरोधी eIF2α, Abcam (A0764));विरोधी eIF2α (फास्फोरस S51), Abcam (ab32157);एंटी-पैक्ट (फास्फोरस S246), एबजेंट (AP7744b);एंटी-बीटा-ट्यूबुलिन, सीएसटी (2128);सामान्य माउस IgG, CST (5415S);सामान्य खरगोश IgG, CST (2729S)।पश्चिमी सोख्ता के लिए PBST में एंटीबॉडी 1:1000 और IP के लिए 1:100 पतला किया गया।
sgRNAs को CRISPR-ERA66 नामक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध टूल का उपयोग करके विकसित किया गया था।हमने sgRNA विकास के लिए डिफ़ॉल्ट टूल पैरामीटर और 3 kb क्षेत्र में एल्गोरिथम गणना sgRNA बाइंडिंग साइट्स का उपयोग किया।टीएसएस पर केंद्रितsgRNA ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के पूल को CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) में संश्लेषित किया गया और मानवकृत pgRNA प्लास्मिड (Addgene #44248) में क्लोन किया गया।डीएनएफेक्ट ट्रांसफेक्शन रिएजेंट का उपयोग करके 10 सेमी डिश में 5 x 106 HEK293T में जमा किए गए मानवकृत pgRNA प्लास्मिड के कुल 12 माइक्रोग्राम, psPAX2 के 7.2 माइक्रोग्राम (Addgene #12260), और pMD2.G के 4.8 माइक्रोग्राम (Addgene #2259) को 5 x 106 HEK293T में सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सेल (CWBIO, बीजिंग, चीन)।वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला अभिकर्मक के 48 और 72 घंटे बाद एकत्र किया गया और 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया।स्क्रीनिंग के लिए, dCas9/KRAB संलयन प्रोटीन को व्यक्त करने वाली SW620 कोशिकाओं को वायरस पारगमन द्वारा प्राप्त किया गया था।संशोधित SW620 कोशिकाओं को 0.1-0.3 के MOI पर चार स्वतंत्र संक्रमण प्रयोगों में वायरस लाइब्रेरी से संक्रमित किया गया था और 2 दिनों के लिए 2 μg / ml पौरोमाइसिन (सिग्मा, सेंट लुइस, MO) के साथ नमूना लिया गया था।इसके बाद, स्क्रीनिंग के लिए 500 कोशिकाओं/sgRNA के न्यूनतम पुस्तकालय कवरेज के साथ इन विट्रो में 18 दिनों के लिए कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया।
जीनोमिक डीएनए को QIAamp डीएनए ब्लड मिडी किट (QIAGEN, डसेलडोर्फ, जर्मनी; 51183) के निर्देशों के अनुसार निकाला गया था।कुल मिलाकर, पुस्तकालय के निर्माण के लिए प्रति जैविक दोहराव में 100 माइक्रोग्राम जीनोमिक डीएनए का उपयोग किया गया था।sgRNA क्षेत्र को पीसीआर के दो दौरों द्वारा प्रवर्धित किया गया और एक बारकोड से जोड़ा गया।
पीसीआर उत्पादों को NucleoSpin® जेल और PCR शुद्धि किट (MACHEREY-NAGEL, Düren, जर्मनी; 740609.250) का उपयोग करके शुद्ध किया गया था और क्यूबिट ™ HS डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए डिटेक्शन किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक; Q32854) का उपयोग करके इसकी मात्रा निर्धारित की गई थी।
सेल प्रसार को मापने के लिए एमटीएस परख का उपयोग किया गया था।2000 कोशिकाओं / कुओं के प्रारंभिक घनत्व पर कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में रखा गया था।कुल 4-6 दिनों के लिए संकेतित समय पर दैनिक रूप से कोशिकाओं की सापेक्ष संख्या को मापा गया।प्रत्येक कुएं के लिए, MTS अभिकर्मक (Promega) के 20 μl को DMEM के 100 μl के साथ पतला किया गया था, 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए कोशिकाओं के साथ ऊष्मायन किया गया था, और फिर OD490 को मापा गया था।
क्षेत्रों के गठन का विश्लेषण करके अनियंत्रित विकास की क्षमता की खोज की गई थी।संक्षेप में, 2000 कोशिकाओं को shRNA DARS-AS1 या नियंत्रण shRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था जो हर 4 दिनों में मध्यम परिवर्तन के साथ अल्ट्रा लो अटैचमेंट माइक्रोप्लेट्स (कॉर्निंग) में सुसंस्कृत थे।14 दिनों के बाद गोलाकारों की गिनती की गई।DARS-AS1 ओवरएक्प्रेशन प्लास्मिड या एक नियंत्रण प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट 500 कोशिकाओं का उपयोग एन्हांसमेंट परख के लिए किया गया था, अन्यथा विधि अपरिवर्तित थी।
Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) के निर्देशों के अनुसार RNA को T7 RNA पोलीमरेज़ और बायोटिन-16-UTP (Roche 1138908910) का उपयोग करके ट्रांसक्राइब किया गया।यहाँ प्रयुक्त प्राइमरों को अनुपूरक तालिका 4 में सूचीबद्ध किया गया है।
प्रोटीन-कोडिंग PACT या PKR क्षेत्रों को PET15b (Addgene #73619) में क्लोन किया गया और BL21 (DE3) में बदल दिया गया।एम्पीसिलीन के साथ आपूर्ति की गई एलबी में बैक्टीरिया को रातोंरात ऊष्मायन किया गया और फिर ताजा एलबी के साथ 100 गुना पतला किया गया।जब माध्यम का OD600 0.8 तक पहुंच गया, तो प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 1 mM IPTG जोड़ा गया।कोमल झटकों (20 डिग्री सेल्सियस पर 250 आरपीएम) के साथ रातोंरात ऊष्मायन के बाद, सेल गोली को सेंट्रीफ्यूजेशन (4000 आरपीएम, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा एकत्र किया गया था।lysis बफर (50 मिमी Tris, पीएच 8.0, 250 मिमी NaCl, 1 मिमी PMSF) में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं, फिर sonicate (15 मिनट, 5 एस पर/बंद, बर्फ पर) और केंद्रापसारक (13,000) आरपीएम)।, 30 मिनट, 4°С)।सतह पर तैरनेवाला तब Ni-NTA राल (QIAGEN) पर 4 ° C पर 3 बार लोड किया गया था, 4 बार वॉश बफर (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM इमिडाज़ोल, 250 mM NaCl) से धोया गया और कुल मिलाकर 3 बार eluted। 10 मिलीलीटर एलुएंट बफर (50 मिमी ट्रिस, पीएच 8.0, 250 मिमी NaCl, 300 मिमी इमिडाज़ोल)।शुद्ध प्रोटीन को WB का उपयोग करके निर्धारित किया गया था और एकाग्रता को क्यूबिट ™ प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक; क्यू 33212) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।
संशोधनों के साथ RIP assays को पहले वर्णित रूप में प्रदर्शित किया गया था।संक्षेप में, 1x RIP बफर (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin राइबोन्यूक्लिअस इनहिबिटर (Promega), PMSF (बायोटाइम बायोटेक्नोलॉजी), 1 mM DDM, प्रोटीज) साइटोस्टैटिक 1 x 107 कॉकटेल को लाइस करता है। (Roche, 1 mM DTT) और 13,000 rpm पर केंद्रापसारक 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ।सतह पर तैरनेवाला तब प्रोटीन ए + जी चुंबकीय मोतियों (मिलिपोर) के साथ ऊष्मायन किया गया था जो 5 माइक्रोग्राम एंटी-पैक्ट एंटीबॉडी (एबीम) या आईजीजी (सीएसटी) के साथ संयुग्मित था।मोतियों को 5x RIP बफर से 5 बार धोया गया, फिर प्रोटीनएज़ K (NEB) से पचाया गया।RNA को Trizol के साथ निकाला गया और RT-qPCR द्वारा निर्धारित किया गया।प्राइमरों को अनुपूरक तालिका 5 में प्रस्तुत किया गया है।
इन विट्रो आरआईपी परख एक संशोधित मानक आरआईपी परख प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था।कुल 5 pmol इन विट्रो ट्रांस्क्राइब्ड RNA को RIP बफर के साथ 1x पतला किया गया और 65 ° C पर 5 मिनट के लिए ऊष्मायन द्वारा annealed किया गया, इसके बाद कमरे के तापमान को धीमी गति से ठंडा किया गया।ई. कोलाई से कुल 5 pmol अक्षुण्ण या उत्परिवर्तित फ्लैग-लेबल PACT प्रोटीन को शुद्ध किया गया।4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पुनर्निर्मित आरएनए के साथ इनक्यूबेट करें और एंटी-फ्लैग आईपी के लिए आरआईपी विश्लेषण के लिए उपरोक्त प्रक्रिया का पालन करें।
आरएनए विस्तार विश्लेषण के लिए, 1 × 107 कोशिकाओं को 1xRIP बफर के साथ lysed किया गया था।4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 13, 000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों (बेकमैन) के 30 μl के साथ 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दर्शाया गया था।शुद्ध लाइसेट को तब खमीर टीआरएनए के साथ आपूर्ति की गई थी और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात आरएनए के 40 पीएमओएल के साथ ऊष्मायन किया गया था, फिर एक और 2 घंटे के लिए और बीएसए के साथ अवरुद्ध नए स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों के 20 μl को जोड़ा गया था।धुलाई चरण में 5x RIP बफर के साथ 4 बार और 1x RIP बफर के साथ 4 बार शामिल था।संबंधित प्रोटीन को बायोटिन रेफरेंस बफर (25 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, 12.5 मिमी डी-बायोटिन, पीएमएसएफ) के साथ मिलाया गया और NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) पर अलग किया गया।सिल्वर स्टेनिंग (बायोटाइम बायोटेक्नोलॉजी) के बाद, एमएस द्वारा कुछ बैंडों का एक्साइज और विश्लेषण किया गया।
PACT और PKR के बीच बातचीत का परीक्षण करने के लिए सह-आईपी विश्लेषण किया गया था।संक्षेप में, सतह पर तैरनेवाला lysates 1 x RIP बफर में 1 x 107 lysed कोशिकाओं को इनक्यूबेट करके तैयार किया गया था, इसके बाद 13,000 rpm पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक किया गया था।Lysates प्रोटीन A + G चुंबकीय मोतियों से भरे हुए थे, जो 5 µg एंटी-पैक्ट एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित थे, और धीरे से 4 ° C पर रात भर घुमाए गए।मोतियों को 3 बार 5 × RIP बफर से, दो बार 1 × RIP बफर से और 1 × SDS बफर से धोया गया।बरामद प्रोटीन का विश्लेषण एसडीएस-पेज जेल द्वारा किया गया और डब्ल्यूबी द्वारा पता लगाया गया।
ई. कोलाई से फ़्लैग्ड PACT के दो pmol और PKR का 1 pmol शुद्ध किया गया।1 × RIP बफर में पतला करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 10 pmol renatured RNA के साथ इनक्यूबेट करें।उसके बाद, उन्हें अतिरिक्त दो घंटे के लिए प्रोटीन ए + जी चुंबकीय मनका-संयुग्मित एंटी-लेबल एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया।मोतियों को फिर 1x RIP बफर से चार बार धोया गया और 1x SDS बफर से उपचारित किया गया।परिणामी PACT और PKR का पता WB ने लगाया।