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सक्रिय एस्टर या फ़िनॉक्सी रेडिकल पर आधारित एंजाइमैटिक निकटता लेबलिंग विधियों का व्यापक रूप से जीवित कोशिकाओं में उप-कोशिकीय प्रोटिओम और प्रोटीन इंटरेक्टर्स को मैप करने के लिए उपयोग किया जाता है।हालांकि, सक्रिय एस्टर कम प्रतिक्रियाशील होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक विस्तृत लेबलिंग त्रिज्या होती है, और पेरोक्साइड उपचार द्वारा उत्पन्न फेनॉक्सी रेडिकल रेडॉक्स मार्गों में हस्तक्षेप कर सकते हैं।यहां हम एक निकटता लेबलिंग आश्रित फोटोएक्टिवेशन (पीडीपीएल) विधि की रिपोर्ट करते हैं जो आनुवंशिक रूप से मिनीएसओजी फोटोसेंसिटाइज़र प्रोटीन को रुचि के प्रोटीन से जोड़कर विकसित की गई है।नीली रोशनी से ट्रिगर और एक्सपोजर समय द्वारा नियंत्रित, सिंगलेट ऑक्सीजन उत्पन्न होता है और फिर एनिलिन जांच द्वारा हिस्टिडीन अवशेषों के स्थानिक रूप से हल किए गए लेबलिंग को प्राप्त किया जाता है।हम ऑर्गेनेल-विशिष्ट प्रोटिओम मैपिंग के माध्यम से इसकी उच्च निष्ठा प्रदर्शित करते हैं।TurboID के साथ PDPL की साथ-साथ तुलना PDPL के अधिक विशिष्ट और व्यापक प्रोटिओमिक कवरेज को दर्शाती है।इसके बाद, हमने पीडीपीएल को रोग से जुड़े ट्रांसक्रिप्शनल कोएक्टीवेटर बीआरडी 4 ​​और ई 3 पार्किन लिगेज पर लागू किया और पहले से अज्ञात इंटरेक्टर्स पाए।ओवरएक्प्रेशन स्क्रीनिंग द्वारा, पार्किन के लिए दो अज्ञात सबस्ट्रेट्स, Ssu72 और SNW1 की पहचान की गई, जिनके क्षरण को सर्वव्यापी-प्रोटिएसम मार्ग द्वारा मध्यस्थ किया गया है।
प्रोटीन नेटवर्क का सटीक लक्षण वर्णन कई मौलिक सेलुलर प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है।इसलिए, प्रोटीन अंतःक्रियाओं का अत्यधिक सटीक स्पोटियोटेम्पोरल मानचित्रण जैविक मार्गों, रोग विकृति विज्ञान को समझने और चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए इन अंतःक्रियाओं को बाधित करने के लिए एक आणविक आधार प्रदान करेगा।यह अंत करने के लिए, जीवित कोशिकाओं या ऊतकों में अस्थायी बातचीत का पता लगाने में सक्षम तरीके अत्यधिक वांछनीय हैं।एफिनिटी प्यूरीफिकेशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी-एमएस) का उपयोग ऐतिहासिक रूप से ब्याज के प्रोटीन (पीओआई) के बाध्यकारी भागीदारों की पहचान करने के लिए किया गया है।मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स विधियों के विकास के साथ, Bioplex3.0 बनाया गया, जो AP-MS पर आधारित प्रोटीन नेटवर्क का सबसे बड़ा डेटाबेस है।हालांकि एपी-एमएस बहुत शक्तिशाली है, वर्कफ़्लो में सेल लसीस और कमजोर पड़ने वाले कदम कमजोर और क्षणिक बाध्यकारी इंटरैक्शन के पक्षपाती हैं और पोस्ट-लिसिस कलाकृतियों को पेश करते हैं जैसे कि नकली इंटरैक्शन जोड़े जिनमें लिसिस से पहले कंपार्टमेंटलाइज़ेशन की कमी होती है।
इन मुद्दों को हल करने के लिए, क्रॉसलिंकिंग समूहों के साथ अप्राकृतिक अमीनो एसिड (UAA) और एंजाइमेटिक पास के लेबलिंग (PL) प्लेटफॉर्म (जैसे APEX और BioID)5 विकसित किए गए हैं।यद्यपि यूएए पद्धति को कई परिदृश्यों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है और प्रत्यक्ष प्रोटीन चिपकने के बारे में जानकारी प्रदान करता है, यूएए प्रविष्टि साइट का अनुकूलन अभी भी आवश्यक है।इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि यह एक स्टोइकोमेट्रिक लेबलिंग पद्धति है जिसमें लेबलिंग घटनाओं के उत्प्रेरक उत्क्रमण का अभाव है।इसके विपरीत, एंजाइमैटिक पीएल तरीके, जैसे कि बायोआईडी विधि, इंजीनियर बायोटिन लिगेज को पीओआई7 में फ्यूज करते हैं, जो बाद में बायोटिन को एक प्रतिक्रियाशील बायोटिनिल-एएमपी एस्टर मध्यवर्ती बनाने के लिए सक्रिय करता है।एंजाइम इस प्रकार एक सक्रिय बायोटिन "क्लाउड" को उत्प्रेरित और मुक्त करता है जो समीपस्थ लाइसिन अवशेषों को लेबल करता है।हालांकि, बायोआईडी को पर्याप्त लेबल सिग्नल प्राप्त करने के लिए 12 घंटे से अधिक की आवश्यकता होती है, जो अस्थायी समाधान के साथ इसके उपयोग को रोकता है।खमीर प्रदर्शन के आधार पर निर्देशित विकास का उपयोग करते हुए, टर्बोआईडी को बायोआईडी के आधार पर अधिक कुशल बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जिससे 10 मिनट के भीतर बायोटिन के साथ कुशल लेबलिंग की अनुमति मिलती है, जिससे अधिक गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सकता है।चूंकि TurboID अत्यधिक सक्रिय है और अंतर्जात बायोटिन का स्तर निम्न-स्तरीय लेबलिंग के लिए पर्याप्त है, पृष्ठभूमि लेबलिंग एक संभावित समस्या बन जाती है जब बहिर्जात बायोटिन के अतिरिक्त द्वारा अत्यधिक संवर्धित और समयबद्ध लेबलिंग की आवश्यकता होती है।इसके अलावा, सक्रिय एस्टर खराब प्रतिक्रियाशील (t1 / 2 ~ 5 मिनट) हैं, जो एक बड़े लेबलिंग त्रिज्या को जन्म दे सकते हैं, विशेष रूप से बायोटिन 5 के साथ पड़ोसी प्रोटीन की संतृप्ति के बाद। एक अन्य दृष्टिकोण में, इंजीनियर एस्कॉर्बेट पेरोक्सीडेज (यानी बायोटिन- का आनुवंशिक संलयन) फिनोल रेडिकल्स और एक मिनट 9,10 के भीतर प्रोटीन लेबलिंग की अनुमति देता है। एपेक्स का व्यापक रूप से उपसेलुलर प्रोटिओम, झिल्ली प्रोटीन कॉम्प्लेक्स, और साइटोसोलिक सिग्नलिंग प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 11,12 की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, पेरोक्साइड की उच्च सांद्रता की आवश्यकता रेडॉक्स प्रोटीन या पथ को प्रभावित कर सकती है, बाधित कर सकती है सेलुलर प्रक्रियाएं।
इस प्रकार, सेलुलर पथों को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किए बिना उच्च स्थानिक और लौकिक सटीकता के साथ अधिक प्रतिक्रियाशील लेबल-त्रिज्या दमन प्रजातियों को उत्पन्न करने में सक्षम एक नई विधि मौजूदा तरीकों के लिए एक महत्वपूर्ण अतिरिक्त होगी। प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में, सिंगलेट ऑक्सीजन ने अपने छोटे जीवनकाल और सीमित प्रसार त्रिज्या (कोशिकाओं में t1 / 2 <0.6 µs) के कारण हमारा ध्यान आकर्षित किया। प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में, सिंगलेट ऑक्सीजन ने अपने छोटे जीवनकाल और सीमित प्रसार त्रिज्या (कोशिकाओं में t1 / 2 <0.6 µs) के कारण हमारा ध्यान आकर्षित किया। Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. सक्रिय रूपों में, सिंगलेट ऑक्सीजन ने अपने छोटे जीवनकाल और सीमित प्रसार त्रिज्या (कोशिकाओं में t1 / 2 <0.6 µs) के कारण हमारा ध्यान आकर्षित किया।t1 / 2 <0.6 μs）而引起了我们的注意13。 1/2 <0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). सक्रिय रूपों में, सिंगलेट ऑक्सीजन अपने छोटे जीवनकाल और सीमित प्रसार त्रिज्या (कोशिकाओं में t1 / 2 <0.6 μs) के कारण हमारा ध्यान आकर्षित करती है।सिंगलेट ऑक्सीजन को मेथियोनीन, टाइरोसिन, हिस्टिडीन और ट्रिप्टोफैन को बेतरतीब ढंग से ऑक्सीकरण करने के लिए सूचित किया गया है, जिससे यह अमाइन या थियोल आधारित जांच के लिए लगाव के लिए ध्रुवीय 14,15 बना देता है।हालांकि सिंगलेट ऑक्सीजन का उपयोग सबसेलुलर कम्पार्टमेंट आरएनए को लेबल करने के लिए किया गया है, अंतर्जात पीओआई निकटता मार्करों को फिर से तैयार करने की रणनीति अस्पष्टीकृत रहती है।यहां, हम फोटोएक्टीवेशन-डिपेंडेंट प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग (पीडीपीएल) नामक एक प्लेटफॉर्म प्रस्तुत करते हैं, जहां हम मिनीएसओजी फोटोसेंसिटाइज़र के साथ जुड़े पीओआई को रोशन करने के लिए नीली रोशनी का उपयोग करते हैं और समीपस्थ अवशेषों को ऑक्सीकरण करने के लिए सिंगलेट ऑक्सीजन पीढ़ी को ट्रिगर करते हैं, इसके बाद रासायनिक जांच को ऑक्सीकरण करने के लिए एमाइन युक्त संशोधन होते हैं। मध्यवर्ती जीवित कोशिकाएँ।.हमने टैग विशिष्टता को अधिकतम करने के लिए रासायनिक जांच के एक समूह का परीक्षण किया और एक खुले प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो का उपयोग करके संशोधन साइटों की पहचान की।TurboID के साथ PDPL की साथ-साथ तुलना PDPL के अधिक विशिष्ट और व्यापक प्रोटिओमिक कवरेज को दर्शाती है।हमने इस दृष्टिकोण को उप-कोशिकीय प्रोटिओम के ऑर्गेनेल-विशिष्ट मार्करों और कैंसर से जुड़े एपिजेनेटिक नियामक प्रोटीन बीआरडी 4 ​​और पार्किंसंस रोग से जुड़े ई 3 लिगेज पार्किन के लिए बाध्यकारी भागीदारों की सामान्य प्रोटिओम पहचान के लिए लागू किया, जिसने प्रोटीन के एक ज्ञात और अज्ञात नेटवर्क दोनों की पुष्टि की। बातचीत।.बड़े प्रोटीन परिसरों में E3 सबस्ट्रेट्स को पहचानने के लिए PDPL की क्षमता एक ऐसी स्थिति का प्रतिनिधित्व करती है जहां अप्रत्यक्ष बाइंडरों की मान्यता की आवश्यकता होती है।ubiquitination-proteasome द्वारा मध्यस्थता वाले दो अज्ञात पार्किन सबस्ट्रेट्स की स्वस्थानी में पुष्टि की गई है।
फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) 19 और क्रोमोफोर-असिस्टेड लेजर इनएक्टिवेशन (CALI) 20, जिसमें फोटोसेंसिटाइज़र के साथ प्रकाश विकिरण सिंगलेट ऑक्सीजन उत्पन्न करता है, लक्ष्य प्रोटीन को निष्क्रिय कर सकता है या कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है।चूंकि सिंगलेट ऑक्सीजन लगभग 70 एनएम की सैद्धांतिक प्रसार दूरी के साथ एक अत्यधिक प्रतिक्रियाशील पदार्थ है, इसलिए फोटोसेंसिटाइज़र के आसपास स्थानिक रूप से सीमित ऑक्सीकरण को नियंत्रित किया जा सकता है।इस अवधारणा के आधार पर, हमने जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन परिसरों की नज़दीकी लेबलिंग प्राप्त करने के लिए सिंगलेट ऑक्सीजन का उपयोग करने का निर्णय लिया।हमने चार कार्यों को पूरा करने के लिए एक पीडीपीएल केमोप्रोटेमिक दृष्टिकोण विकसित किया है: (1) पीएल एंजाइमेटिक दृष्टिकोण के समान सक्रिय सिंगलेट ऑक्सीजन की पीढ़ी को उत्प्रेरित करने के लिए;(2) प्रकाश दीक्षा पर समय-समाधान लेबलिंग प्रदान करें;(3) परिवर्तन द्वारा (4) पृष्ठभूमि को कम करने के लिए अंतर्जात कॉफ़ैक्टर्स (जैसे बायोटिन) का उपयोग करने से बचें, या पर्यावरणीय तनाव के लिए सेल जोखिम को कम करने के लिए अत्यधिक परेशान बहिर्जात अभिकर्मकों (जैसे पेरोक्साइड) का उपयोग करें।
फोटोसेंसिटाइज़र को दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है जिसमें छोटे आणविक भार फ्लोरोफोर्स (जैसे गुलाब बंगाल, मेथिलीन नीला) 22 और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड छोटे प्रोटीन (जैसे मिनीएसओजी, किलररेड)23 शामिल हैं।मॉड्यूलर डिजाइन प्राप्त करने के लिए, हमने POI24,25 (चित्र 1a) में फोटोसेंसिटाइज़र (PS) प्रोटीन जोड़कर पहली पीढ़ी का PDPL प्लेटफॉर्म विकसित किया।जब नीली रोशनी से विकिरणित होता है, तो सिंगलेट ऑक्सीजन समीपस्थ न्यूक्लियोफिलिक अमीनो एसिड अवशेषों का ऑक्सीकरण करता है, जिसके परिणामस्वरूप एक umpolung ध्रुवता होती है जो इलेक्ट्रोफिलिक होती है और आगे अमाइन जांच न्यूक्लियोफाइल के साथ प्रतिक्रिया कर सकती है।जांच को क्लिक रसायन शास्त्र की अनुमति देने और एलसी/एमएस/एमएस लक्षण वर्णन के लिए नीचे खींचने के लिए एक अल्कीन हैंडल के साथ डिज़ाइन किया गया है।
मिनीएसओजी द्वारा मध्यस्थता वाले प्रोटीन परिसरों की लेबलिंग का योजनाबद्ध चित्रण।नीली रोशनी के संपर्क में आने पर, मिनीएसओजी-पीओआई व्यक्त करने वाली कोशिकाएं सिंगलेट ऑक्सीजन उत्पन्न करती हैं, जो अंतःक्रियात्मक प्रोटीन को संशोधित करती है लेकिन गैर-बाध्यकारी प्रोटीन को नहीं।फोटोऑक्सीडेशन के मध्यवर्ती उत्पादों को अमीन रासायनिक जांच के रिले लेबल द्वारा सहसंयोजक व्यसनों के निर्माण के लिए इंटरसेप्ट किया जाता है।रसायन विज्ञान जांच पर एल्केनाइल समूह एलसी-एमएस/एमएस क्वांटिटेशन के बाद पुल-डाउन द्वारा संवर्धन के लिए क्लिक रसायन शास्त्र की अनुमति देता है।बी अमीन जांच की रासायनिक संरचना 1-4।ग माइटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकृत मिनीएसओजी-मध्यस्थता वाले प्रोटिओमिक मार्करों का प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट जेल विश्लेषण 1-4 जांच और जेल डेंसिटोमेट्री पर आधारित सापेक्ष मात्रा का उपयोग करता है।रासायनिक जांच के सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात का मूल्यांकन नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों का उपयोग करके नीली रोशनी को छोड़कर या मिनीएसओजी अभिव्यक्ति के बिना HEK293T कोशिकाओं का उपयोग करके किया गया था।n = 2 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने।प्रत्येक बिंदु एक जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है।डी संकेतित पीडीपीएल घटकों की उपस्थिति या अनुपस्थिति में अनुकूलित जांच 3 का उपयोग करके पीडीपीएल की प्रतिनिधि पहचान और मात्रा का ठहराव सी।n = 3 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने।प्रत्येक बिंदु एक जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है।केंद्र रेखाएं और मूंछें माध्य और ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं।सीबीबी: कोमास्सी ब्रिलियंट ब्लू।दूर लाल सी-डीएमए दाग के साथ सिंगलेट ऑक्सीजन की ई कन्फोकल इमेजिंग।स्केल बार: 10 µm.जेल इमेजिंग और कंफोकल प्रयोगों को समान परिणामों के साथ कम से कम दो बार स्वतंत्र रूप से दोहराया गया था।
हमने पहली बार परिपक्व फोटोसेंसिटाइज़र मिनीएसओजी 26 और किलररेड 23 की क्षमता का परीक्षण किया, जो कि एचईके 293 टी में स्पष्ट रूप से व्यक्त किया गया था, एक रासायनिक जांच (सप्लीमेंट्री अंजीर 1 ए) के रूप में प्रोटिओम के प्रोपरगिलामाइन लेबलिंग की मध्यस्थता करने के लिए।जेल फ्लोरेसेंस विश्लेषण से पता चला है कि मिनीएसओजी और ब्लू लाइट विकिरण का उपयोग करके संपूर्ण प्रोटीम लेबलिंग हासिल की गई थी, जबकि किलररेड के साथ कोई दृश्यमान लेबलिंग उत्पाद नहीं देखा गया था।सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात में सुधार करने के लिए, हमने फिर एनिलिन (1 और 3), प्रोपाइलामाइन (2), या बेंज़िलमाइन (4) युक्त रासायनिक जांच के एक सेट का परीक्षण किया।हमने देखा कि HEK293T कोशिकाओं में स्वयं नीली रोशनी की तुलना में उच्च पृष्ठभूमि संकेत था, संभवतः अंतर्जात राइबोफ्लेविन फोटोसेंसिटाइज़र, फ्लेविन मोनोन्यूक्लियोटाइड (FMN) 27 के कारण। अनिलिन-आधारित रासायनिक जांच 1 और 3 ने बेहतर विशिष्टता दी, HEK293T ने माइटोकॉन्ड्रिया में मिनीएसओजी को सख्ती से व्यक्त करते हुए जांच 3 के लिए सिग्नल में 8 गुना वृद्धि प्रदर्शित की, जबकि जांच 2 आरएनए-लेबलिंग विधि सीएपी-सीक्यू में केवल ~ 2.5- प्रदर्शित करती है। गुना संकेत वृद्धि, आरएनए और प्रोटीन (छवि 1 बी, सी) के बीच विभिन्न प्रतिक्रियाशीलता वरीयताओं के कारण होने की संभावना है। अनिलिन-आधारित रासायनिक जांच 1 और 3 ने बेहतर विशिष्टता दी, HEK293T ने माइटोकॉन्ड्रिया में मिनीएसओजी को सख्ती से व्यक्त करते हुए जांच 3 के लिए सिग्नल में 8 गुना वृद्धि प्रदर्शित की, जबकि जांच 2 आरएनए-लेबलिंग विधि सीएपी-सीक्यू में केवल ~ 2.5- प्रदर्शित करती है। गुना संकेत वृद्धि, आरएनए और प्रोटीन (छवि 1 बी, सी) के बीच विभिन्न प्रतिक्रियाशीलता वरीयताओं के कारण होने की संभावना है।अनिलिन-आधारित रासायनिक जांच 1 और 3 ने बेहतर विशिष्टता दिखाई: HEK293T, जो माइटोकॉन्ड्रिया में मिनीएसओजी को स्पष्ट रूप से व्यक्त करता है, जांच 3 के लिए संकेत में 8 गुना से अधिक वृद्धि दिखाता है, जबकि जांच 2, केवल CAP-seq RNA लेबलिंग विधि में उपयोग किया जाता है। आरएनए और प्रोटीन (छवि 1 बी, सी) के बीच अलग-अलग प्रतिक्रियाशीलता वरीयताओं के कारण शायद ~ 2.5 गुना संकेत वृद्धि दिखाता है।1 和3 HEK293T miniSOG，探针3 的信号增加> 8 आरएनए 标记方法CAP-seq 的探针2 ~ 2.5-आरएनए 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。1 和 3 ， hek293t मिनीसोग 3 > 8 आरएनए 标记 कैप-ईक 的 2 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于आरएनएअनिलिन-आधारित रासायनिक जांच 1 और 3 में बेहतर विशिष्टता थी, HEK293T ने माइटोकॉन्ड्रिया में मिनीएसओजी को स्पष्ट रूप से व्यक्त किया, और जांच 3 में सिग्नल में 8 गुना से अधिक वृद्धि हुई, जबकि सीएपी-सीक्यू आरएनए लेबलिंग विधि के लिए जांच 2 में केवल ~ 2.5 गुना वृद्धि दिखाई गई।संकेत में, शायद आरएनए और प्रोटीन (छवि 1 बी, सी) के बीच अलग-अलग प्रतिक्रिया वरीयताओं के कारण।इसके अलावा, जांच 3 आइसोमर्स और हाइड्राज़िन जांच (जांच 5, 6, 7) का परीक्षण किया गया, जो जांच 3 (सप्लीमेंट्री अंजीर 1 बी, सी) के अनुकूलन की पुष्टि करता है।इसी तरह, इन-जेल प्रतिदीप्ति विश्लेषण ने अन्य अनुकूलित प्रयोगात्मक मापदंडों का खुलासा किया: विकिरण तरंग दैर्ध्य (460 एनएम), रासायनिक जांच एकाग्रता (1 मिमी), और विकिरण समय (20 मिनट) (पूरक छवि 2 ए-सी)।पीडीपीएल प्रोटोकॉल में किसी भी घटक या कदम को छोड़ने से पृष्ठभूमि में महत्वपूर्ण संकेत उलट हो गया (चित्र 1 डी)।विशेष रूप से, सोडियम एजाइड या ट्रोलॉक्स की उपस्थिति में प्रोटीन लेबलिंग काफी कम हो गई थी, जो सिंगलेट ऑक्सीजन को बुझाने के लिए जाने जाते हैं।D2O की उपस्थिति, जिसे सिंगलेट ऑक्सीजन को स्थिर करने के लिए जाना जाता है, लेबलिंग सिग्नल को बढ़ाता है।लेबलिंग में अन्य प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के योगदान की जांच करने के लिए, मैनिटोल और विटामिन सी को क्रमशः 18, 29, हाइड्रॉक्सिल और सुपरऑक्साइड रेडिकल मैला ढोने वालों को स्थापित करने के लिए जोड़ा गया था, लेकिन वे लेबलिंग को कम करने के लिए नहीं पाए गए।H2O2 का जोड़, लेकिन रोशनी नहीं, लेबलिंग (सप्लीमेंट्री अंजीर। 3 ए) के परिणामस्वरूप नहीं हुआ।सी-डीएमए जांच के साथ प्रतिदीप्ति सिंगलेट ऑक्सीजन इमेजिंग ने HEK293T-miniSOG तार में सिंगलेट ऑक्सीजन की उपस्थिति की पुष्टि की, लेकिन मूल HEK293T तार में नहीं।इसके अलावा, माइटोसॉक्स रेड रोशनी के बाद सुपरऑक्साइड उत्पादन का पता नहीं लगा सका (छवि 1e और अनुपूरक चित्र। 3 बी) 30। ये डेटा दृढ़ता से सुझाव देते हैं कि सिंगलेट ऑक्सीजन मुख्य प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति है जो बाद के प्रोटिओमिक लेबलिंग के लिए जिम्मेदार है।पीडीपीएल की साइटोटोक्सिसिटी का मूल्यांकन नीले प्रकाश विकिरण और रासायनिक जांच सहित किया गया था, और कोई महत्वपूर्ण साइटोटोक्सिसिटी नहीं देखी गई थी (पूरक छवि 4 ए)।
लेबलिंग तंत्र का अध्ययन करने और एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके प्रोटीन परिसरों की प्रोटिओमिक पहचान को सक्षम करने के लिए, हमें पहले यह निर्धारित करने की आवश्यकता है कि कौन से अमीनो एसिड संशोधित हैं और जांच लेबल के डेल्टा द्रव्यमान।मेथियोनीन, हिस्टिडाइन, ट्रिप्टोफैन और टायरोसिन को सिंगलेट ऑक्सीजन द्वारा संशोधित किए जाने की सूचना मिली है।हम MSFragger32 पर आधारित FragPipe कंप्यूटिंग प्लेटफॉर्म द्वारा प्रदान की गई निष्पक्ष खुली खोज के साथ TOP-ABPP31 वर्कफ़्लो को एकीकृत करते हैं।सिंगलेट ऑक्सीजन संशोधन और रासायनिक जांच लेबलिंग के बाद, क्लीवेबल लिंकर युक्त बायोटिन रिडक्शन लेबल का उपयोग करके क्लिक केमिस्ट्री का प्रदर्शन किया गया, इसके बाद न्यूट्रैविडिन स्ट्रेचिंग और ट्रिप्सिन पाचन किया गया।संशोधित पेप्टाइड, जो अभी भी राल से बंधा है, LC-MS/MS विश्लेषण (चित्र 2a और अनुपूरक डेटा 1) के लिए photocleaved था।50 से अधिक पेप्टाइड मैप (PSM) मैचों की सूची (चित्र 2बी) के साथ पूरे प्रोटिओम में बड़ी संख्या में संशोधन हुए।आश्चर्यजनक रूप से, हमने केवल हिस्टिडाइन के संशोधन को देखा, शायद अन्य अमीनो एसिड की तुलना में एनिलिन जांच के प्रति ऑक्सीकृत हिस्टिडीन की उच्च प्रतिक्रियाशीलता के कारण।सिंगलेट ऑक्सीजन द्वारा हिस्टिडीन ऑक्सीकरण के प्रकाशित तंत्र के अनुसार, 21,33 प्रस्तावित डेल्टा-मास संरचना +229 दा दो ऑक्सीकरणों के बाद 2-ऑक्सो-हिस्टिडाइन के साथ जांच 3 के जोड़ से मेल खाती है, जबकि +247 दा हाइड्रोलिसिस उत्पाद है। +229 दा का (पूरक चित्र 5)।MS2 स्पेक्ट्रम के मूल्यांकन ने अधिकांश y और b आयनों की पहचान की उच्च विश्वसनीयता दिखाई, जिसमें संशोधित अंश आयनों (y और b) (चित्र। 2c) की पहचान शामिल है।पीडीपीएल-संशोधित हिस्टिडाइन के स्थानीय अनुक्रम के संदर्भ विश्लेषण ने ± 1 पदों (सप्लीमेंट्री अंजीर। 4 बी) पर छोटे हाइड्रोफोबिक अवशेषों के लिए एक मध्यम रूपांकन वरीयता का खुलासा किया।प्रति प्रोटीन औसतन 1.4 हिस्टिडाइन की पहचान की गई थी, और इन मार्करों की साइटों को विलायक सुलभ सतह क्षेत्र (एसएएसए) और सापेक्ष विलायक उपलब्धता (आरएसए) विश्लेषण (पूरक छवि 4 सी, डी) द्वारा निर्धारित किया गया था।
MSFragger द्वारा संचालित FragPipe कंप्यूटिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके अवशिष्ट चयनात्मकता का अध्ययन करने के लिए एक निष्पक्ष कार्यप्रवाह।स्ट्रेप्टाविडिन राल से संशोधित पेप्टाइड्स के फोटोक्लेवेज की अनुमति देने के लिए क्लिक रसायन विज्ञान में क्लीवेबल लिंकर्स का उपयोग किया जाता है।कई संशोधनों, साथ ही प्रासंगिक अवशेषों की पहचान के लिए एक खुली खोज शुरू की गई थी।बी पूरे प्रोटिओम में होने वाले संशोधनों के द्रव्यमान को असाइन करें।पेप्टाइड मैपिंग पीएसएम।c MS2 जांच के साथ संशोधित हिस्टिडीन साइटों का वर्णक्रमीय एनोटेशन। एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, जांच 3 के साथ एक सहसंयोजक प्रतिक्रिया ने संशोधित अमीनो एसिड में +229.0938 दा जोड़ा।डी उत्परिवर्तन परख पीडीपीएल मार्करों के परीक्षण के लिए प्रयोग किया जाता है।PRDX3 (H155A, H225A) और PRDX1 (H10A, H81A, H169A) को एंटी-फ्लैग डिटेक्शन के लिए वाइल्ड-टाइप प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया।ई सिंथेटिक पेप्टाइड को जांच 3 की उपस्थिति में शुद्ध मिनीएसओजी के साथ प्रतिक्रिया दी गई थी और एलसी-एमएस स्पेक्ट्रम में m +247 और +229 के साथ संबंधित उत्पादों को नोट किया गया था।f इन विट्रो प्रोटीन-टू-प्रोटीन इंटरैक्शन मिनीSOG-6xHis-tag और एंटी-6xHis एंटीबॉडी के साथ मॉडलिंग किया गया।प्रकाश के संपर्क के समय के आधार पर, जांच 3 के साथ लेबल किए गए मिनीएसओजी-6xHis/एंटी-6xHis एंटीबॉडी परिसरों का एंटीबायोटिक (स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी) और एंटी-माउस वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण।व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए लेबल संबंधित आणविक भार में व्यक्त किए जाते हैं: एलसी एंटीबॉडी प्रकाश श्रृंखला, एचसी एंटीबॉडी भारी श्रृंखला।इन प्रयोगों को समान परिणामों के साथ कम से कम दो बार स्वतंत्र रूप से दोहराया गया था।
लेबलिंग साइट के जैव रासायनिक सत्यापन के लिए, मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाने गए PRDX3 और PRDX1 को हिस्टिडीन से ऐलेनिन में बदल दिया गया और ट्रांसफेक्शन एसेज़ में जंगली प्रकार की तुलना में।पीडीपीएल के परिणामों से पता चला है कि उत्परिवर्तन ने लेबलिंग को काफी कम कर दिया (छवि 2 डी)।इस बीच, खुली खोज में पहचाने गए पेप्टाइड अनुक्रमों को संश्लेषित किया गया और जांच 3 और नीली रोशनी की उपस्थिति में शुद्ध मिनीएसओजी के साथ इन विट्रो में प्रतिक्रिया की गई, एलसी-एमएस (अंजीर) द्वारा पता लगाए जाने पर +247 और +229 दा के बड़े पैमाने पर बदलाव वाले उत्पादों की उपज। 2ई)।)यह जांचने के लिए कि क्या मिनीएसओजी फोटोएक्टीवेशन के जवाब में समीपस्थ प्रोटीन को इन विट्रो में लेबल किया जा सकता है, हमने मिनीएसओजी -6xHis प्रोटीन और इन विट्रो (चित्रा 2f) में एक एंटी-हिज मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बीच बातचीत द्वारा एक कृत्रिम निकटता परख तैयार की।इस परख में, हमें मिनीएसओजी के साथ एंटीबॉडी भारी और हल्की श्रृंखलाओं के समीपस्थ लेबलिंग की उम्मीद थी।वास्तव में, एंटी-माउस (एंटी-6xHis-लेबल एंटीबॉडी की भारी और हल्की श्रृंखलाओं को पहचानना) और स्ट्रेप्टाविडिन वेस्टर्न ब्लॉट्स ने भारी और हल्की श्रृंखलाओं का मजबूत बायोटिनाइलेशन दिखाया।विशेष रूप से, हमने 6xHis टैग और प्रकाश और भारी श्रृंखलाओं के बीच क्रॉस-लिंक के कारण मिनीएसओजी ऑटोबायोटिनाइलेशन देखा, जो लाइसिन और 2-ऑक्सो-हिस्टिडाइन समीपस्थ प्रतिक्रिया के बीच पहले वर्णित अंतर से संबंधित हो सकता है।अंत में, हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि पीडीपीएल हिस्टिडीन को निकटता पर निर्भर तरीके से संशोधित करता है।
हमारा अगला लक्ष्य स्वस्थानी लेबलिंग की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए उप-कोशिकीय प्रोटिओम को चिह्नित करना था।इसलिए, हमने नाभिक, माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स, या HEK293T कोशिकाओं के बाहरी ईआर झिल्ली (छवि 3 ए) में मिनीएसओजी को सख्ती से व्यक्त किया।जेल प्रतिदीप्ति विश्लेषण ने तीन उपकोशिकीय स्थानों के साथ-साथ विभिन्न लेबलिंग पैटर्न (छवि 3 बी) पर प्रचुर मात्रा में लेबल वाले बैंड का खुलासा किया।प्रतिदीप्ति इमेजिंग विश्लेषण ने पीडीपीएल (छवि 3 सी) की उच्च विशिष्टता दिखाई।पीडीपीएल वर्कफ़्लो के बाद रोडामाइन रंजक के साथ क्लिक प्रतिक्रियाओं के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उप-कोशिकीय प्रोटिओम को चित्रित किया गया था, और पीडीपीएल संकेतों को डीएपीआई, माइटोकॉन्ड्रियल ट्रैकर्स या ईआर ट्रैकर्स के साथ कोलोकलाइज़ किया गया था, जो पीडीपीएल की उच्च निष्ठा की पुष्टि करता है।तीन ऑर्गेनेल स्थानों के लिए, एविडिन वेस्टर्न ब्लॉट का उपयोग करके टर्बोआईडी के साथ पीडीपीएल की एक साथ-साथ तुलना ने दिखाया कि पीडीपीएल को उनके संबंधित नियंत्रणों की तुलना में अधिक विशेष रूप से लेबल किया गया था।पीडीपीएल स्थितियों के तहत, अधिक लेबल वाले बैंड दिखाई दिए, जो अधिक पीडीपीएल-लेबल वाले प्रोटीन (सप्लीमेंट्री अंजीर। 6 ए-डी) का संकेत देते हैं।
मिनीएसओजी-मध्यस्थता वाले ऑर्गेनेल-विशिष्ट प्रोटिओम लेबलिंग का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।miniSOG मानव COX4 (mito-miniSOG) के N-टर्मिनल 23 अमीनो एसिड, H2B (नाभिक-मिनीSOG) के संलयन के माध्यम से नाभिक, और ER झिल्ली (ER-miniSOG) के साइटोप्लाज्मिक पक्ष के माध्यम से Sec61β के संलयन के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स को लक्षित करता है। )संकेतों में जेल इमेजिंग, कन्फोकल इमेजिंग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री शामिल हैं।b तीन ऑर्गेनेल-विशिष्ट PDPL प्रोफाइल के प्रतिनिधि जेल चित्र।सीबीबी कोमास्सी ब्रिलियंट ब्लू।c HEK293T कोशिकाओं के प्रतिनिधि मुखर चित्र, V5 (लाल) लेबल वाले एंटीबॉडी द्वारा ज्ञात विभिन्न उप-कोशिकीय स्थानीयकरणों के साथ मिनीएसओजी को स्पष्ट रूप से व्यक्त करते हैं।उपकोशिकीय मार्करों का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया और ईआर (हरा) के लिए किया जाता है।PDPL वर्कफ़्लो में Cy3-azide क्लिक केमिस्ट्री का उपयोग करके मिनीएसओजी (पीला) लेबल वाले सबसेलुलर प्रोटिओम का पता लगाना शामिल है।स्केल बार: 10 µm.डी पीडीपीएल-टैग किए गए प्रोटिओम के ज्वालामुखी भूखंडों को विभिन्न जीवों में गैर-लेबल मात्रा का ठहराव (एन = 3 स्वतंत्र जैविक प्रयोग) द्वारा निर्धारित किया गया है।ज्वालामुखी भूखंडों पर टू-टेल्ड स्टूडेंट के टी-टेस्ट का इस्तेमाल किया गया था।HEK293T जंगली प्रकार का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है (p <0.05 और> 2-गुना आयन तीव्रता अंतर)। महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है (p <0.05 और> 2-गुना आयन तीव्रता अंतर)। начительно измененные елки выделены красным ветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов)। महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है (p <0.05 और> आयन तीव्रता में 2-गुना अंतर)।पी <0.05 和> 2पी <0.05和> 2 начительно измененные елки выделены красным ветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе)। महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है (p <0.05 और> आयनिक शक्ति में 2 गुना अंतर)।HEK293T-miniSOG के लिए महत्वपूर्ण संबंधित प्रोटीन लेकिन HEK293T के लिए महत्वपूर्ण नहीं हरे रंग में दिखाए गए हैं।ई प्रयोगों से प्रोटिओमिक डेटासेट की विशिष्टता का विश्लेषण डी।प्रत्येक ऑर्गेनेल (लाल और हरे डॉट्स) में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण प्रोटीन की कुल संख्या शीर्ष पर चिह्नित है।हिस्टोग्राम माइटोकार्टा 3.0, जीओ विश्लेषण और ए। टिंग एट अल के आधार पर ऑर्गेनेल में स्थानीयकृत प्रोटीन दिखाते हैं।लोग।माइटोकॉन्ड्रिया, नाभिक और ईआर के लिए अलग डेटासेट।इन प्रयोगों को समान परिणामों के साथ कम से कम दो बार स्वतंत्र रूप से दोहराया गया था।कच्चे डेटा कच्चे डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किए जाते हैं।
जेल और इमेजिंग परिणामों से उत्साहित होकर, प्रत्येक ऑर्गेनेल (सप्लीमेंट्री डेटा 2) में पहचाने गए प्रोटिओम को निर्धारित करने के लिए लेबल-मुक्त परिमाणीकरण का उपयोग किया गया था।पृष्ठभूमि मार्करों को घटाने के लिए असंक्रमित HEK293T का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। ज्वालामुखी प्लॉट विश्लेषण ने काफी समृद्ध प्रोटीन (पी <0.05 और> 2-गुना आयन तीव्रता) के साथ-साथ सिंगलटन प्रोटीन प्रदर्शित किए जो केवल मिनीएसओजी-व्यक्त लाइनों (छवि 3 डी लाल और हरे रंग के डॉट्स) में मौजूद हैं। ज्वालामुखी प्लॉट विश्लेषण ने काफी समृद्ध प्रोटीन (पी <0.05 और> 2-गुना आयन तीव्रता) के साथ-साथ सिंगलटन प्रोटीन प्रदर्शित किए जो केवल मिनीएसओजी-व्यक्त लाइनों (छवि 3 डी लाल और हरे रंग के डॉट्स) में मौजूद हैं। Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). ज्वालामुखी प्लॉट विश्लेषण ने काफी समृद्ध प्रोटीन (पी <0.05 और> 2-गुना आयन तीव्रता) के साथ-साथ एकल प्रोटीन दिखाया जो केवल मिनीएसओजी-व्यक्त लाइनों (छवि 3 डी, लाल और हरे रंग के डॉट्स) में मौजूद हैं।पी <0.05 和>2 मिनीएसओजी 表达系中的单一蛋白质（图3डीp <0.05 和> 2 मिनीसोग 3डी 红色 Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). ज्वालामुखी प्लॉट विश्लेषण ने काफी समृद्ध प्रोटीन (पी <0.05 और> 2x आयनिक ताकत) के साथ-साथ केवल मिनीएसओजी अभिव्यक्ति लाइन (छवि 3 डी में लाल और हरे रंग के डॉट्स) में मौजूद एकल प्रोटीन का खुलासा किया।इन आंकड़ों को मिलाकर, हमने क्रमशः 1364, 461, और 911 सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परमाणु, माइटोकॉन्ड्रियल और ईआर बाहरी झिल्ली प्रोटीन की पहचान की।ऑर्गेनेल-स्थानीयकृत पीडीपीएल की सटीकता का विश्लेषण करने के लिए, हमने मिटोकार्टा 3.0, जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) विश्लेषण और ए। टिंग एट अल का उपयोग किया।73.4, 78.5, और 73.0% (चित्र 3ई) की सटीकता के अनुरूप, ज्ञात प्रोटीन की ऑर्गेनेल विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया, न्यूक्लियस और ईआर के लिए एक डेटा सेट 8 का उपयोग किया गया था।पीडीपीएल की विशिष्टता इस बात की पुष्टि करती है कि पीडीपीएल ऑर्गेनेल-विशिष्ट प्रोटिओम की पहचान करने के लिए एक आदर्श उपकरण है।विशेष रूप से, पहचाने गए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के सबमिटोकॉन्ड्रियल विश्लेषण से पता चला है कि फंसे हुए प्रोटिओम को मुख्य रूप से मैट्रिक्स और आंतरिक झिल्ली (क्रमशः 226 और 106) में वितरित किया गया था, जो कि पहचाने गए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की कुल संख्या का 91.7% (362) है।पीडीपीएल के एक उच्च स्तर की अतिरिक्त रूप से पुष्टि की गई (पूरक छवि 7 ए)।इसी तरह, उप-परमाणु विश्लेषण से पता चला कि कैप्चर किए गए प्रोटिओम को मुख्य रूप से न्यूक्लियस, न्यूक्लियोप्लाज्म और न्यूक्लियोलस (सप्लीमेंट्री अंजीर। 7 बी) में वितरित किया गया था।परमाणु स्थानीयकरण संकेत पेप्टाइड (3xNLS) के साथ परमाणु प्रोटिओमिक विश्लेषण ने H2B निर्माण (सप्लीमेंट्री अंजीर। 7c-h) के समान सटीकता दिखाई।PDPL मार्कर की विशिष्टता को निर्धारित करने के लिए, परमाणु लैमिनिन A को अधिक विवेकपूर्ण स्थानीयकृत POI7 ट्रैप के रूप में चुना गया था।पीडीपीएल ने 36 महत्वपूर्ण रूप से समृद्ध प्रोटीनों की पहचान की, जिनमें से 12 प्रोटीन (लेमिन ए सहित 30.0%) अच्छी तरह से विशेषता वाले लैमिन ए इंटरेक्टिंग प्रोटीन थे, जो स्ट्रिंग डेटाबेस द्वारा एनोटेट किए गए, बायोआईडी विधि (122 प्रोटीन) 28 में से 28 की तुलना में अधिक प्रतिशत के साथ। , 22.9 %) 7. हमारी पद्धति ने कम प्रोटीन की पहचान की, संभवतः सीमित लेबलिंग क्षेत्रों के कारण, जो अधिक सक्रिय सिंगलेट ऑक्सीजन द्वारा संभव बनाया गया था।जीओ विश्लेषण से पता चला है कि पहचाने गए प्रोटीन मुख्य रूप से न्यूक्लियोप्लाज्म (26), परमाणु झिल्ली (10), परमाणु झिल्ली (9), और परमाणु छिद्र (5) में स्थित थे।सामूहिक रूप से, इन परमाणु-स्थानीयकृत प्रोटीनों में 80% समृद्ध प्रोटीन होते हैं, जो आगे PDPL (सप्लीमेंट्री अंजीर। 8a-d) की विशिष्टता को प्रदर्शित करते हैं।
ऑर्गेनेल में निकटता अंकन करने के लिए पीडीपीएल की क्षमता स्थापित करने के बाद, हमने तब परीक्षण किया कि क्या पीडीपीएल का उपयोग पीओआई बाध्यकारी भागीदारों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।विशेष रूप से, हमने साइटोसोलिक प्रोटीन के पीडीपीएल विश्लेषण को परिभाषित करने की मांग की, जिन्हें उनके अत्यधिक गतिशील प्रकृति के कारण उनके झिल्ली-स्थानीयकृत समकक्षों की तुलना में अधिक कठिन लक्ष्य माना जाता है।ब्रोमोडोमैन और एक्स्ट्राटर्मिनल (बीईटी) प्रोटीन बीआरडी 4 ​​ने विभिन्न रोगों 35, 36 में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए हमारा ध्यान आकर्षित किया है।BRD4 द्वारा गठित कॉम्प्लेक्स एक ट्रांसक्रिप्शनल कोएक्टीवेटर और एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य है।C-myc और Wnt5a प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति को विनियमित करके, BRD4 को तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (AML), मल्टीपल मायलोमा, बर्किट के लिंफोमा, पेट के कैंसर और सूजन संबंधी बीमारियों का एक प्रमुख निर्धारक माना जाता है।इसके अलावा, कुछ वायरस वायरल और सेलुलर ट्रांसक्रिप्शन को विनियमित करने के लिए BRD4 को लक्षित करते हैं, जैसे कि पेपिलोमावायरस, एचआईवी और SARS-CoV-236,39।
PDPL का उपयोग करके BRD4 इंटरैक्शन को मैप करने के लिए, हमने miniSOG को BRD4 के छोटे N- या C-टर्मिनल आइसोफॉर्म के साथ जोड़ा।प्रोटिओमिक परिणामों ने दो निर्माणों (सप्लीमेंट्री अंजीर। 9 ए) के बीच उच्च स्तर के ओवरलैप का खुलासा किया।मिनीएसओजी-एच2बी के साथ पहचाने जाने वाले परमाणु प्रोटिओम में बीआरडी4 (सप्लीमेंट्री अंजीर। 9बी) के साथ परस्पर क्रिया करने वाले 77.6% प्रोटीन शामिल हैं।फिर, मार्कर त्रिज्या (छवि 4 ए और पूरक डेटा 3) को समायोजित करने के लिए रोशनी के अलग-अलग समय (2, 5, 10, 20 मिनट) का उपयोग किया गया।हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि छोटे फोटोपेरियोड में, पीडीपीएल मुख्य रूप से प्रत्यक्ष बाध्यकारी भागीदारों को लेबल करेगा, जबकि लंबी अवधि में कम फोटोएक्टिवेशन अवधि के दौरान पहचाने जाने वाले प्रोटीन के साथ-साथ लेबलिंग कॉम्प्लेक्स में अप्रत्यक्ष लक्ष्य शामिल होंगे।वास्तव में, हमने आसन्न समय बिंदुओं (2 और 5 मिनट के लिए 84.6%; 5 और 10 मिनट के लिए 87.7%; 10 और 20 मिनट के लिए 98.7%) (छवि 4 बी और अनुपूरक चित्र। 9 सी) के बीच मजबूत ओवरलैप पाया।सभी प्रायोगिक समूहों में, हमने न केवल BRD4 स्व-लेबलिंग पाया, बल्कि कई ज्ञात लक्ष्य जैसे MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, और HMGB1 को स्ट्रिंग डेटाबेस में एनोटेट किया।इन लक्ष्यों की आयनिक शक्ति एक्सपोज़र समय (छवि 4c और अनुपूरक चित्र। 9d) के समानुपाती होती है।2 मिनट के समूह में पहचाने गए प्रोटीन के जीओ विश्लेषण से पता चला कि पहचाने गए प्रोटीन नाभिक में स्थानीयकृत थे और क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग और आरएनए पोलीमरेज़ फ़ंक्शन में शामिल थे।प्रोटीन के आणविक कार्य को क्रोमेटिन बाइंडिंग या ट्रांसक्रिप्शनल कोएक्टीवेशन में समृद्ध किया गया था, जो बीआरडी 4 ​​फ़ंक्शन (छवि 4 डी) के अनुरूप है।स्ट्रिंग डेटाबेस-सक्षम प्रोटीन इंटरैक्शन विश्लेषण ने BRD4 और HDAC परिवार इंटरेक्टिंग कॉम्प्लेक्स जैसे SIN3A, NCOR2, BCOR, और SAP130 (छवि 4e और अनुपूरक चित्र। 9e) के बीच अप्रत्यक्ष बातचीत के पहले स्तर का खुलासा किया, जो BRD4 और HDAC बाइंडिंग एसिटिलेटेड हिस्टोन के अनुरूप है। ..इसके अलावा, LC-MS/MS द्वारा पहचाने गए प्रतिनिधि लक्ष्य, जिनमें Sin3A, NSUN2, Fus और SFPQ शामिल हैं, की पुष्टि वेस्टर्न ब्लॉटिंग (चित्र 4f) द्वारा की गई थी।हाल ही में, BRD4 के लघु समस्थानिक को तरल-तरल चरण पृथक्करण (LLPS) गुणों के साथ नाभिक बनाने की सूचना मिली है।आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन फ्यूस और एसएफपीक्यू विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं के एलएलपीएस की मध्यस्थता करते हैं और यहां उन्हें बिना रिकॉर्ड किए गए बीआरडी 4 ​​बाध्यकारी प्रोटीन के रूप में पहचाना गया है।BRD4 और SFPQ के बीच की बातचीत की पुष्टि सह-इम्युनोप्रेरीगेशन (सह-आईपी) प्रयोगों (चित्र 4g) द्वारा की गई थी, जो आगे की जांच के योग्य BRD4 की मध्यस्थता वाले तरल-तरल चरण पृथक्करण के लिए एक और तंत्र का सुझाव देती है।एक साथ लिया गया, ये परिणाम बताते हैं कि पीडीपीएल ज्ञात बीआरडी 4 ​​इंटरेक्टिंग के साथ-साथ अज्ञात बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक आदर्श मंच है।
मिनीएसओजी-मध्यस्थ बीआरडी4 निकटता अंकन का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, एक्सपोजर समय: 2, 5, 10, और 20 मिनट।बी विभिन्न रोशनी समय पर पहचाने गए प्रोटीन का ओवरलैप।HEK293T-miniSOG-BRD4 में पहचाना गया प्रोटीन संवर्धन जंगली प्रकार HEK293T की तुलना में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था।सी आयन तीव्रता जब निर्दिष्ट जोखिम समय के दौरान ज्ञात बीआरडी 4-बाइंडिंग प्रोटीन के बिना लेबल वाले प्रतिनिधि की मात्रा निर्धारित करता है।n = 3 जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने।डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है।d 2 मिनट के समूह में पहचाने गए प्रोटीन का जीन ऑन्कोलॉजिकल विश्लेषण (GO)।पहले दस GO शब्द सूचीबद्ध हैं।बुलबुले गो टर्म श्रेणी के अनुसार रंगीन होते हैं, और बुलबुले का आकार प्रत्येक शब्द में पाए जाने वाले प्रोटीन की संख्या के समानुपाती होता है।बीआरडी4 के साथ परस्पर क्रिया करने वाले प्रोटीन का ई स्ट्रिंग विश्लेषण।पीले घेरे प्रत्यक्ष गोंद हैं और ग्रे घेरे अप्रत्यक्ष गोंद की पहली परत हैं।लाल रेखाएं प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित अंतःक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं और नीली रेखाएं अनुमानित अंतःक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं।f प्रतिनिधि BRD4 LC-MS/MS में पहचाने गए बाध्यकारी लक्ष्य पश्चिमी सोख्ता द्वारा सत्यापित किए गए थे।g सह-इम्युनोप्रेरीगेशन प्रयोग SFPQ और BRD4 के बीच परस्पर क्रिया की पुष्टि करते हैं।इन प्रयोगों को समान परिणामों के साथ कम से कम दो बार स्वतंत्र रूप से दोहराया गया था।कच्चे डेटा कच्चे डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किए जाते हैं।
अपंजीकृत पीओआई-संबद्ध लक्ष्यों की पहचान करने के अलावा, हम अनुमान लगाते हैं कि पीडीपीएल एंजाइमों के लिए सब्सट्रेट की पहचान करने के लिए उपयुक्त होगा, जिसके लिए अपंजीकृत सब्सट्रेट्स को एनोटेट करने के लिए बड़े परिसरों में अप्रत्यक्ष बाध्यकारी प्रोटीन के लक्षण वर्णन की आवश्यकता होगी।पार्किन (PARK2 द्वारा एन्कोडेड) एक E3 लिगेज है और पार्किन में उत्परिवर्तन ऑटोसोमल रिसेसिव जुवेनाइल पार्किंसन रोग (एआर-जेपी)42 का कारण बनता है।इसके अलावा, पार्किन को माइटोफैगी (माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी) और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को हटाने के लिए आवश्यक बताया गया है।हालांकि, हालांकि कई पार्किन सबस्ट्रेट्स की पहचान की गई है, इस बीमारी में पार्किन की भूमिका स्पष्ट नहीं है।इसके अप्रचलित सबस्ट्रेट्स को एनोटेट करने के लिए, पार्किन के एन- या सी-टर्मिनस में मिनीएसओजी जोड़कर पीडीपीएल का परीक्षण किया गया था।PINK1-Parkin मार्ग के माध्यम से पार्किन को सक्रिय करने के लिए कोशिकाओं को कार्बोनिल साइनाइड प्रोटॉन ट्रांसपोर्टर m-chlorophenylhydrazone (CCCP) के साथ इलाज किया गया था।हमारे बीआरडी 4 ​​पीडीपीएल परिणामों की तुलना में, पार्किन एन-टर्मिनस फ्यूजन ने लक्ष्य प्रोटीन का एक बड़ा सेट प्रकट किया, हालांकि इसने सी-टर्मिनस (210 में से 177) (चित्रा 5 ए, बी और पूरक डेटा 4) के एक बड़े हिस्से को कवर किया।परिणाम रिपोर्ट के अनुरूप है कि एन-टर्मिनल टैग अचानक पार्किन44 को सक्रिय कर सकते हैं।हैरानी की बात है कि हमारे डेटा में पार्किन43 के लिए प्रकाशित एपी-एमएस परिणामों के साथ केवल 18 अतिव्यापी प्रोटीन थे, संभवतः सेल लाइनों और प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो के बीच अंतर के कारण।चार ज्ञात प्रोटीनों (ARDM1, HSPA8, PSMD14, और PSMC3) के अलावा दो विधियों द्वारा पहचाने गए (चित्र 5c)43।एलसी-एमएस / एमएस के परिणामों को और अधिक मान्य करने के लिए, पीडीपीएल उपचार और बाद में पश्चिमी सोख्ता का उपयोग HEK293T पैरेंट सेल परख और स्थिर एन-टर्मिनल पार्किन लाइन के परिणामों की तुलना करने के लिए किया गया था।पहले अज्ञात लक्ष्य CDK2, DUT, CTBP1, और PSMC4 का परीक्षण एक ज्ञात बाइंडर, DNAJB1 (चित्र 5d) के साथ किया गया था।
HEK293T कोशिकाओं में पार्किन-इंटरेक्टिंग प्रोटीन का ज्वालामुखी प्लॉट, पार्किन के N- या C-टर्मिनस (n = 3 स्वतंत्र जैविक प्रयोग) से जुड़े हुए मिनीएसओजी के साथ।ज्वालामुखी भूखंडों पर टू-टेल्ड स्टूडेंट के टी-टेस्ट का इस्तेमाल किया गया था।HEK293T का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है (p <0.05 और> 2-गुना आयन तीव्रता अंतर)। महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है (p <0.05 और> 2-गुना आयन तीव्रता अंतर)। начительно измененные елки выделены красным ветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов)। महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है (p <0.05 और> आयन तीव्रता में 2-गुना अंतर)।पी <0.05 和> 2पी <0.05和> 2 начительно измененные елки выделены красным ветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе)। महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है (p <0.05 और> आयनिक शक्ति में 2 गुना अंतर)।HEK293T-miniSOG के लिए महत्वपूर्ण संबंधित प्रोटीन लेकिन HEK293T के लिए महत्वपूर्ण नहीं हरे रंग में दिखाए गए हैं।बी वेन आरेख एन-टर्मिनल और सी-टर्मिनल निर्माणों के बीच अतिव्यापी प्रोटीन दिखा रहा है।एन-टर्मिनल टैग अचानक पार्किन को सक्रिय कर सकते हैं और परिणामस्वरूप अधिक पहचानने योग्य प्रोटीन हो सकते हैं।सी वेन आरेख पीडीपीएल और एपी-एमएस के बीच अतिव्यापी प्रोटीन दिखा रहा है।ज्ञात अंतःक्रियाओं को सूचीबद्ध किया गया है, जिसमें 18 में से 4 अतिव्यापी प्रोटीन और पीडीपीएल में विशेष रूप से पहचाने गए 159 प्रोटीनों में से 11 शामिल हैं।d LC-MS/MS द्वारा पहचाने गए प्रतिनिधि लक्ष्यों को वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा सत्यापित किया गया।e Ssu72 और SNW1 को अपंजीकृत पार्किन सबस्ट्रेट्स के रूप में पहचाना गया।इन फ्लैग-टैग किए गए प्रोटीन प्लास्मिडों को HEK293T और HEK293T-Parkin-miniSOG में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और इसके बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर CCCP उपचार किया गया।पार्किन ओवरएक्प्रेशन लाइन में गिरावट अधिक स्पष्ट थी।f प्रोटीसम इनहिबिटर MG132 का उपयोग करते हुए, यह पुष्टि की गई कि Ssu72 और SNW1 की गिरावट प्रक्रिया को प्रोटीसम-सर्वव्यापीकरण द्वारा मध्यस्थ किया गया है।इन प्रयोगों को समान परिणामों के साथ कम से कम दो बार स्वतंत्र रूप से दोहराया गया था।कच्चे डेटा कच्चे डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किए जाते हैं।
विशेष रूप से, पीडीपीएल द्वारा पहचाने गए प्रोटीन में पार्किन-बाइंडिंग प्रोटीन और उनके सबस्ट्रेट्स शामिल होने चाहिए।अपंजीकृत पार्किन सबस्ट्रेट्स का पता लगाने के लिए, हमने सात पहचाने गए प्रोटीन (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 और SNW1) का चयन किया और इन जीनों को सामान्य HEK293T में उजागर करने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट प्लास्मिड का चयन किया और CCCP उपचार के बाद मिनीएसओजी-पार्किंस के HEK293T को स्पष्ट रूप से व्यक्त किया।स्थिर मिनीएसओजी-पार्किं लाइन (चित्र 5e) में Ssu72 और SNW1 प्रोटीन का स्तर काफी कम हो गया था।12 घंटे के लिए सीसीसीपी के साथ उपचार के परिणामस्वरूप दोनों सबस्ट्रेट्स का सबसे महत्वपूर्ण क्षरण हुआ।यह जांचने के लिए कि क्या Ssu72 और SNW1 के क्षरण को प्रोटीसम-सर्वव्यापीकरण द्वारा नियंत्रित किया जाता है, प्रोटीसोम अवरोधक MG132 को प्रोटीसोम गतिविधि को बाधित करने के लिए जोड़ा गया था, और वास्तव में हमने पाया कि उनकी गिरावट प्रक्रिया बाधित थी (चित्र 5f)।अतिरिक्त गैर-सब्सट्रेट लक्ष्यों की पुष्टि पश्चिमी सोख्ता (सप्लीमेंट्री अंजीर। 10) का उपयोग करते हुए पार्किन इंटरेक्टर्स के रूप में की गई थी, जो एलसी-एमएस / एमएस के अनुरूप परिणाम दिखाते थे।अंत में, लक्ष्य प्रोटीन अभिकर्मक सत्यापन के साथ PDPL कार्यप्रवाह का एकीकरण अपंजीकृत E3 लिगेज सबस्ट्रेट्स की पहचान की अनुमति देता है।
हमने एक कॉमन प्रॉक्सिमिटी मार्किंग प्लेटफॉर्म विकसित किया है जो आपको स्पेस और टाइम इंटरेक्टिंग पीओआई की पहचान करने की अनुमति देता है।मंच मिनीएसओजी फोटोसेंसिटाइज़र प्रोटीन पर आधारित है, जो केवल 12 केडीए है, परिपक्व एपेक्स2 एंजाइम (27 केडीए) के आधे से भी कम और टर्बोआईडी (35 केडीए) के आकार का एक तिहाई है।छोटे आकार को छोटे प्रोटीन अंतःक्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुप्रयोगों की सीमा का विस्तार करना चाहिए।अतिरिक्त फोटोसेंसिटाइज़र की आगे की खोज, चाहे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड प्रोटीन या छोटे अणु, सिंगलेट ऑक्सीजन की क्वांटम उपज बढ़ाने और इस दृष्टिकोण की संवेदनशीलता का विस्तार करने के लिए आवश्यक हैं।मिनीएसओजी के वर्तमान संस्करण के लिए, निकटता मार्करों को सक्रिय करने के लिए नीली रोशनी का उपयोग करके उच्च अस्थायी समाधान प्राप्त किया जा सकता है।इसके अलावा, लंबे समय तक एक्सपोजर समय ने सिंगलेट ऑक्सीजन का एक बड़ा "क्लाउड" जारी किया, जिसके परिणामस्वरूप अधिक डिस्टल हिस्टिडीन अवशेषों में संशोधन हुआ, लेबलिंग त्रिज्या में वृद्धि हुई, और पीडीपीएल स्थानिक संकल्प को ठीक करने की क्षमता थी।हमने सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात को बढ़ाने के लिए सात रासायनिक जांचों का भी परीक्षण किया और इस दृष्टिकोण के पीछे आणविक तंत्र का पता लगाया।निष्पक्ष खुली खोज के साथ संयुक्त टॉप-एबीपीपी वर्कफ़्लो ने पुष्टि की कि संशोधन केवल हिस्टिडाइन में हुए थे और लूप क्षेत्र में हिस्टिडाइन के लिए एक मध्यम वरीयता को छोड़कर, बढ़े हुए हिस्टिडीन संशोधनों के लिए कोई सुसंगत माइक्रोएन्वायरमेंट नहीं देखा गया था।
पीडीपीएल का उपयोग अन्य निकटता लेबलिंग और ऑर्गेनेल-विशिष्ट रासायनिक जांच विधियों की तुलना में कम से कम प्रोटिओम विशिष्टता और कवरेज के साथ उप-कोशिकीय प्रोटिओम को चिह्नित करने के लिए भी किया गया है।निकटता मार्करों का उपयोग सतह, लाइसोसोमल और स्रावी-जुड़े प्रोटिओम 46, 47 को चिह्नित करने के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया है।हमें विश्वास है कि पीडीपीएल इन सबसेलुलर ऑर्गेनेल के साथ संगत होगा।इसके अलावा, हमने पीडीपीएल को साइटोसोलिक प्रोटीन बाइंडिंग के लक्ष्यों की पहचान करके चुनौती दी है जो कि उनके गतिशील गुणों और अधिक अस्थायी बातचीत में शामिल होने के कारण झिल्ली बाध्य प्रोटीन की तुलना में अधिक जटिल हैं।PDPL को दो प्रोटीनों, ट्रांसक्रिप्शनल कोएक्टीवेटर BRD4 और रोग-संबंधी लिगेज E3 पार्किन पर लागू किया गया था।इन दो प्रोटीनों को न केवल उनके मौलिक जैविक कार्यों के लिए, बल्कि उनकी नैदानिक ​​प्रासंगिकता और चिकित्सीय क्षमता के लिए भी चुना गया था।इन दो पीओआई के लिए, जाने-माने बाध्यकारी भागीदारों के साथ-साथ अपंजीकृत लक्ष्यों की पहचान की गई थी।विशेष रूप से, चरण पृथक्करण से जुड़े प्रोटीन SFPQ की सह-आईपी द्वारा पुष्टि की गई थी, जो एक नए तंत्र का संकेत दे सकता है जिसके द्वारा BRD4 (लघु आइसोफॉर्म) LLPS को नियंत्रित करता है।साथ ही, हम मानते हैं कि पार्किन सबस्ट्रेट्स की पहचान एक ऐसा परिदृश्य है जिसमें अप्रत्यक्ष चिपकने की पहचान की आवश्यकता होती है।हमने दो अज्ञात पार्किन सबस्ट्रेट्स की पहचान की और सर्वव्यापी-प्रोटिएसम मार्ग के साथ उनके क्षरण की पुष्टि की।हाल ही में, एक तंत्र-आधारित ट्रैपिंग रणनीति विकसित की गई है ताकि हाइड्रोलेस सबस्ट्रेट्स को एंजाइमों के साथ फंसाकर उनका पता लगाया जा सके।हालांकि यह एक बहुत ही शक्तिशाली तरीका है, यह बड़े परिसरों के निर्माण में शामिल सबस्ट्रेट्स के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है और एंजाइम और सब्सट्रेट के बीच सहसंयोजक बंधनों के गठन की आवश्यकता होती है।हम उम्मीद करते हैं कि पीडीपीएल को अन्य प्रोटीन परिसरों और एंजाइम परिवारों, जैसे कि ड्युबिकिटिनेज और मेटालोप्रोटीज परिवारों का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
मिनीएसओजी का एक नया रूप, जिसे SOPP3 कहा जाता है, को बेहतर सिंगलेट ऑक्सीजन उत्पादन के साथ विकसित किया गया है।हमने SOPP3 के साथ मिनीएसओजी की तुलना की और बेहतर अंकन प्रदर्शन पाया, हालांकि सिग्नल-टू-शोर अनुपात अपरिवर्तित रहा (सप्लीमेंट्री अंजीर। 11)।हमने अनुमान लगाया कि SOPP3 का अनुकूलन (जैसे, निर्देशित विकास के माध्यम से) अधिक कुशल फोटोसेंसिटाइज़र प्रोटीन को जन्म देगा, जिसके लिए कम प्रकाश समय की आवश्यकता होती है और इस प्रकार अधिक गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं को कैप्चर करने की अनुमति मिलती है।विशेष रूप से, पीडीपीएल का वर्तमान संस्करण सेलुलर वातावरण तक सीमित है क्योंकि इसके लिए नीली रोशनी की आवश्यकता होती है और यह गहरे ऊतकों में प्रवेश नहीं कर सकता है।यह सुविधा पशु मॉडल अध्ययनों में इसके उपयोग को रोकती है।हालांकि, पीडीपीएल के साथ ऑप्टोजेनेटिक्स का संयोजन विशेष रूप से मस्तिष्क में पशु अनुसंधान के लिए एक अवसर प्रदान कर सकता है।इसके अलावा, अन्य इंजीनियर इन्फ्रारेड फोटोसेंसिटाइज़र भी इस सीमा को हटा देते हैं।इस क्षेत्र में फिलहाल अनुसंधान चल रहा है।
HEK293T सेल लाइन ATCC (CRL-3216) से प्राप्त की गई थी।सेल लाइन ने माइकोप्लाज्मा संक्रमण के लिए नकारात्मक परीक्षण किया और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS, Vistech, # SE100-B) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (Hyclone, # SV30010) के साथ पूरक DMEM (थर्मो, # C11995500BT) में सुसंस्कृत किया गया।में उगना।
3-अमीनोफेनिलीन (नमूना 3) और (4-एथिनिलफेनिल) मेथेनामाइन (नमूना 4) बिडेफार्म से खरीदे गए थे।Propylamine (जांच 2) ऊर्जा-रसायनों से खरीदा गया था।N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (जांच 1) प्रकाशित विधियों के अनुसार संश्लेषित किया गया था।
अनुपूरक तालिका 1 इस अध्ययन में प्रयुक्त आनुवंशिक निर्माणों को सूचीबद्ध करती है।मिनीएसओजी और किलररेड अनुक्रमों को पी. ज़ू (पेकिंग विश्वविद्यालय) के एक उपहार प्लास्मिड से क्लोन किया गया था।माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स लक्ष्यीकरण अनुक्रम COX4 के 23 एन-टर्मिनल अमीनो एसिड से प्राप्त किया गया था और गिब्सन असेंबली (बायोटाइम, # D7010S) का उपयोग करके संकेतित वैक्टर में क्लोन किया गया था।एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम की झिल्ली और नाभिक को लक्षित करने के लिए, SEC61B मानव डीएनए (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) को HEK293T कोशिकाओं की सीडीएनए लाइब्रेरी से पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया गया, और H2B डीएनए (डी। लिन, शेन्ज़ेन बे प्रयोगशाला द्वारा दान किया गया) और क्लोन, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है।जब तक अन्यथा संकेत नहीं दिया जाता है, स्थिर सेल लाइनों के अभिकर्मक और निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य प्रोटीन जीन को HEK293T सेल सीडीएनए लाइब्रेरी से पीसीआर प्रवर्धित किया गया था।G3S (GGGS) और G4S (GGGGS) को चारा प्रोटीन और मिनीएसओजी के बीच लिंकर्स के रूप में इस्तेमाल किया गया था।इन फ्यूजन निर्माणों में एक V5 एपिटोप टैग (GKPIPNPLGLDST) जोड़ा गया था।स्तनधारियों में अभिव्यक्ति के लिए और एक स्थिर सेल लाइन स्थापित करने के लिए, मिनीएसओजी फ्यूजन निर्माण को pLX304 लेंटिवायरल वेक्टर में शामिल किया गया था।जीवाणु अभिव्यक्ति के लिए, मिनीएसओजी को सी-टर्मिनस पर 6xHis लेबल वाले PET21a वेक्टर में क्लोन किया गया था।
HEK293T कोशिकाओं को छह-अच्छी तरह से प्लेटों में 2.0 x 105 कोशिकाओं प्रति कुएं पर लगाया गया था और 24 घंटे बाद पुनः संयोजक लेंटिवायरल प्लास्मिड (2.4 μg pLX304) और वायरल पैकेजिंग प्लास्मिड (1.5 μg psPAX2 और 1.2 μg pMD2.G) के साथ लिपो 8000 (बायोटाइम) का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। , #C0533), लगभग 80% फ्यूजन।रात भर अभिकर्मक के बाद, माध्यम को बदल दिया गया और 24 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया।वायरस का कलेक्शन 24, 48 और 72 घंटे के बाद किया गया।लक्ष्य सेल लाइनों के संक्रमण से पहले, वायरल माध्यम को 0.8 माइक्रोन फिल्टर (मर्क, # मिललेक्स-जीपी) के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था और पॉलीब्रिन (सोलरबियो, # एच8761) को 8 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में जोड़ा गया था।24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को माध्यम बदलकर ठीक होने दिया गया।कम कड़े चयन के रूप में पहले तीन मार्ग के लिए 5 μg / ml ब्लास्टिकिडिन (Solarbio, # 3513-03-9) का उपयोग करके कोशिकाओं का चयन किया गया था।फिर अगले तीन मार्ग के लिए अधिक कठोर आहार के रूप में 20 माइक्रोग्राम / एमएल का इस्तेमाल किया।
कोशिकाओं को लगभग 20,000 कोशिकाओं प्रति कुएं के घनत्व पर 12-वेल कक्षों (इबिडी, #81201) में रखा गया था।HEK293T कोशिकाओं के आसंजन में सुधार करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, सांगोन, # बी640435) में पतला 50 माइक्रोग्राम/एमएल फ़ाइब्रोनेक्टिन (कॉर्निंग, #356008) जोड़ें।1 घंटे के लिए कक्षों का ढोंग किया गया और फिर पीबीएस के साथ हटा दिया गया।24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को एक बार पीबीएस से धोया गया, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ताजा हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस, गिब्को, # 14025092) में 1 मिमी जांच 3 के साथ ऊष्मायन किया गया, और फिर एक नीली एलईडी (460 एनएम) के साथ ऊष्मायन किया गया। )) कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए विकिरणित थे।उसके बाद, कोशिकाओं को दो बार पीबीएस से धोया गया और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस (सैंगोन, # E672002) में 4% फॉर्मलाडेहाइड के साथ तय किया गया।पीबीएस के साथ तीन बार धोकर अतिरिक्त फॉर्मलाडेहाइड को निश्चित कोशिकाओं से हटा दिया गया था।कोशिकाओं को तब पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 (सैंगोन, # ए600198) के साथ पारगम्य किया गया और पीबीएस के साथ 3 बार धोया गया।फिर चैम्बर को हटा दें और एक क्लिक रिएक्शन मिश्रण के 25 μl नमूने में जोड़ें जिसमें 50 माइक्रोन Cy3-azide (अलादीन, #C196720), 2 मिमी CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 मिमी BTTAA (Confluore, #BDJ-4) शामिल हैं। और 0.5 मिलीग्राम / एमएल सोडियम एस्कॉर्बेट (अलादीन, संख्या एस 105024) और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया।एक स्नैप प्रतिक्रिया के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ छह बार धोया गया जिसमें 0.05% ट्वीन -20 (सैंगोन, # A600560) (PBST) था और फिर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए PBST में 5% BSA (Abcone, # B24726) के साथ अवरुद्ध किया गया था।
कोलोकलाइज़ेशन इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, कोशिकाओं को संकेतित स्थितियों के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया था: माउस एंटी-वी 5 टैग एमएबी (1: 500, सीएसटी, # 80076), खरगोश एंटी-एचएसपी 60 एमएबी (1: 1000), एबीक्लोनल, # ए0564), खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-कैल्नेक्सिन एंटीबॉडी (1:500, Abcam, #ab22595) या खरगोश विरोधी लैमिन ए/सी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1:500; सीएसटी, #2032) रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।पीबीएसटी के साथ 3 बार धोने के बाद, कोशिकाओं को द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया: बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 488 (थर्मो, # ए 11034) पतला 1: 1000, बकरी विरोधी माउस एलेक्सा फ्लोर 594 (सीएसटी, # 8889) पतला 1: 1000।30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पतला पतला।कोशिकाओं को तब पीबीएसटी से 3 बार धोया गया और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में डीएपीआई (थर्मो, # डी 1306) के साथ काउंटरस्टैंड किया गया।पीबीएस के साथ 3 washes के बाद, इमेजिंग के लिए पीबीएस में कोशिकाओं को 50% ग्लिसरॉल (सैंगोन, # A600232) में सील कर दिया गया था।एक ZEISS LSM 900 Airyscan2 कन्फोकल माइक्रोस्कोप और ZNE 3.5 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियां प्राप्त की गईं।
सिंगलेट ऑक्सीजन फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए, हैंक्स HEPES बफर (DOJINDO, # MT05) में 100 nM Si-DMA जोड़ने से पहले कोशिकाओं को हैंक्स HEPES बफर से दो बार धोया गया था।प्रकाश के संपर्क में आने के बाद, कोशिकाओं को 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ2 इनक्यूबेटर में ऊष्मायन किया गया था।कोशिकाओं को फिर दो बार हैंक्स के HEPES बफर से धोया गया और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए हैंक्स के HEPES बफर में Hoechst के साथ काउंटरस्टैंड किया गया और ZEISS LSM 900 कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की गई।, #M36008) कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त HBSS बफर में।प्रकाश या डॉक्सोरूबिसिन (MCE, # HY-15142A) के संपर्क में आने के बाद, कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 37 ° C पर CO2 इनक्यूबेटर में ऊष्मायन किया गया, HBSS बफर से दो बार धोया गया, और कमरे के तापमान पर HBSS बफर में Hoechst के साथ ऊष्मायन किया गया।मिनट।डॉक्सोरूबिसिन का उपयोग एक सकारात्मक जांच नियंत्रण के रूप में किया गया था जहां कोशिकाओं को एचबीएसएस में 20 माइक्रोन डॉक्सोरूबिसिन के साथ इलाज किया गया था जिसमें 30 मिनट के लिए 1% बीएसए था।एक Zeiss LSM 900 कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियां प्राप्त की गईं।
माइटो-मिनीएसओजी को स्पष्ट रूप से व्यक्त करने वाली HEK293T कोशिकाओं को 15 सेमी व्यंजनों में लगभग 30% के घनत्व पर रखा गया था।48 घंटों के बाद, जब ~ 80% संगम पर पहुंच गया, कोशिकाओं को एक बार पीबीएस से धोया गया, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ताजा एचबीएसएस बफर में 1 मिमी जांच 3 के साथ ऊष्मायन किया गया और फिर कमरे में 10 मिनट के लिए नीली एलईडी से रोशन किया गया। तापमान।.इसके बाद, कोशिकाओं को दो बार पीबीएस से धोया गया, EDTA मुक्त प्रोटीज इनहिबिटर (MCE, # HY-K0011) युक्त बर्फ-ठंडे पीबीएस बफर में स्क्रैप और resuspended।1 मिनट (1 सेकंड ऑन और 1 सेकंड ऑफ 35% आयाम पर) के लिए टिप को sonicating करके कोशिकाओं को lysed किया गया था।परिणामी मिश्रण को मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,871 xg पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और सतह पर तैरनेवाला एकाग्रता बीसीए प्रोटीन परख किट (बायोटाइम, # P0009) का उपयोग करके 4 मिलीग्राम / एमएल में समायोजित किया गया था।ऊपर lysate के 1 मिलीलीटर को 0.1 mM photodegradable बायोटिन azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA लिगैंड (अलादीन, #T162437), और नीचे के साथ 1 mM CuSO4 इनक्यूबेटर के साथ मिलाएं। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए रोटेशन।एक स्नैप प्रतिक्रिया के बाद, मिश्रण को 10 मिलीलीटर कांच की शीशी में पूर्व-मिश्रित समाधान (MeOH:CHCl3:H2O = 4 मिलीलीटर:1 मिलीलीटर:3 मिलीलीटर) में मिलाएं।नमूनों को मिश्रित किया गया और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।निचले और ऊपरी समाधानों को त्याग दिया गया था, अवक्षेप को 1 मिली मेथनॉल से दो बार धोया गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 15871 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था।25 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट (एबीसी, अलादीन, संख्या ए 110539) में 8 एम यूरिया (अलादीन, संख्या यू111902) का 1 मिलीलीटर जोड़ें।नमूने को 55 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 10 मिमी डाइथियोथेरिटोल (सैंगोन, 25 मिमी एबीसी में # ए100281) के साथ पुनर्गठित किया गया और इसके बाद अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिमी ताजा आयोडोएसेटामाइड (सैंगोन, # ए600539) मिलाया गया।30 मिनट के भीतर क्षारीकरण।.प्रतिक्रिया को रोकने के लिए एक अतिरिक्त 5 मिमी dithiothreitol जोड़ा गया था।1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ 3 बार धो कर प्रत्येक नमूने के लिए लगभग 100 μl NeutrAvidin agarose मोती (थर्मो, #29202) तैयार करें।उपरोक्त प्रोटिओम घोल को 5 मिली पीबीएस के साथ पतला किया गया था और कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए पूर्व-धोए गए न्यूट्रैविडिन agarose मोतियों के साथ ऊष्मायन किया गया था।मोतियों को फिर 5 मिली पीबीएस से 0.2% एसडीएस (सांगोन, # ए 600485) से 3 बार धोया गया, 3 बार 5 एमएल पीबीएस में 1 एम यूरिया और 3 बार 5 मिली डीडीएच 2 ओ के साथ धोया गया।मोतियों को तब सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया और 25 मिमी एबीसी के 200 μl में 1 एम यूरिया, 1 मिमी CaCl 2 (मैकलिन, # C805228) और 20 एनजी / μl ट्रिप्सिन (Promega, # V5280) युक्त resuspended।37 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ रातोंरात trypsinize ।पीएच 2-3 तक पहुंचने तक फॉर्मिक एसिड (थर्मो, # ए117-50) जोड़कर प्रतिक्रिया रोक दी गई थी।मोतियों को 3 बार पीबीएस के 1 मिली से 0.2% एसडीएस, 3 बार पीबीएस के 1 मिली के साथ 1 एम यूरिया और फिर 3 बार 1 मिली डिस्टिल्ड वॉटर से धोया गया।संशोधित पेप्टाइड्स को 70% MeOH के 200 μl का उपयोग करके 90 मिनट के लिए प्रकाश लसीका (365 एनएम) द्वारा जारी किया गया था।सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था।मोतियों को एक बार 70% MeOH के 100 μl से धोया गया और सतह पर तैरनेवाला जमा किया गया।नमूनों को स्पीडवैक वैक्यूम सांद्रक में सुखाया गया और विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया।
सिंगलेट ऑक्सीजन संशोधित पेप्टाइड्स की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए, नमूनों को 0.1% फॉर्मिक एसिड में फिर से भंग कर दिया गया था और पेप्टाइड्स के 1 μg का विश्लेषण ऑर्बिट्रैप फ्यूजन लुमोस ट्राइब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके किया गया था, जो ट्यून से नैनो ईएसआई स्रोत और विक्रेता सॉफ्टवेयर 4.3 से एक्सकैलिबर से लैस था।नमूने 75 माइक्रोन × 15 सेमी आंतरिक रूप से पैक केशिका स्तंभ पर 3 माइक्रोन C18 सामग्री (ReproSil-pur, #r13.b9.) के साथ अलग किए गए थे और एक EASY-nLC 1200 UHPLC सिस्टम (थर्मो) से जुड़े थे।पेप्टाइड्स को रैखिक 95 मिनट की ढाल क्रोमैटोग्राफी द्वारा 8% विलायक बी से 50% विलायक बी (पानी में ए = 0.1% फॉर्मिक एसिड, 80% एसीटोनिट्राइल में बी = 0.1% फॉर्मिक एसिड) द्वारा अलग किया गया था, फिर रैखिक रूप से बढ़कर 98% बी मिनट हो गया। 300 nl/मिनट की प्रवाह दर से 6 मिनट में।Orbitrap Fusion Lumos डेटा के आधार पर पूर्ण MS स्कैन और MS2 स्कैन के बीच बारी-बारी से डेटा एकत्र करता है।स्पटरिंग वोल्टेज 2.1 केवी पर सेट किया गया था और आयन परिवहन केशिका का तापमान 320 डिग्री सेल्सियस था।MS स्पेक्ट्रा (350-2000 m/z) 120,000, AGC 4 × 105, और 150 ms के अधिकतम इनपुट समय के एक संकल्प के साथ एकत्र किए गए थे।प्रत्येक पूर्ण स्कैन में 10 सबसे आम गुणा चार्ज किए गए अग्रदूतों को एचसीडी का उपयोग करके 30% की सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा, 1.6 मीटर/जेड की चौगुनी अलगाव खिड़की और 30,000 की संकल्प सेटिंग के साथ खंडित किया गया था।5×104 और अधिकतम इनपुट समय 150 एमएस का उपयोग करते हुए अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एक एजीसी लक्ष्य।गतिशील अपवाद 30 सेकंड पर सेट है। असाइन नहीं किए गए आयन या 1+ और>7+ के चार्ज वाले लोगों को MS/MS के लिए अस्वीकार कर दिया गया था। असाइन नहीं किए गए आयन या 1+ और>7+ के चार्ज वाले लोगों को MS/MS के लिए अस्वीकार कर दिया गया था। еназначенные ион или ионы с арядом 1+ и >7+ ли отклонены ля /МС. MS/MS के लिए 1+ और >7+ के चार्ज वाले अनसाइन्ड आयन या आयन अस्वीकार कर दिए गए थे।未指定的离子或电荷为1+ >7+ एमएस/एमएस。未指定的离子或电荷为1+ >7+ एमएस/एमएस。 еуказанные ионы или ионы с арядами 1+ и >7+ ли отклонены ля /МС. MS/MS के लिए 1+ और >7+ के अनिर्दिष्ट आयनों या आयनों को अस्वीकार कर दिया गया था।
कच्चे डेटा को MSFragger पर आधारित FragPipe कंप्यूटिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके संसाधित किया जाता है।बड़े पैमाने पर पूर्वाग्रह और संबंधित अमीनो एसिड को एक खुली खोज एल्गोरिथ्म का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जिसमें -150 से 500 दा के अग्रदूत द्रव्यमान सहिष्णुता थी।संशोधित पेप्टाइड्स को तब पीडी (प्रोटिओम डिस्कवरर 2.5, थर्मो) में +229.0964 और +247.1069 दा के बड़े लाभ के साथ हिस्टिडीन संशोधनों का उपयोग करके पहचाना गया था।
फ़्यूज़ किए गए मिनीएसओजी जीन को स्पष्ट रूप से व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को 6 सेमी व्यंजन में चढ़ाया गया था।~ 80% संगम पर पहुंचने पर, कोशिकाओं को एक बार HBSS (गिब्को, # 14025092) से धोया गया, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए HBSS में रासायनिक जांच के साथ ऊष्मायन किया गया और नीली रोशनी से रोशन किया गया।कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 10W एलईडी।यह निर्धारित करने के लिए कि PDPL में किस प्रकार की प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति शामिल है, 0.5 mM विटामिन C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (सिग्मा, #7789-20-0) , 100 मिमी मैनिटोल (ऊर्जा रसायन, # 69-65-8), 100 μM H2O2, 10 मिमी NaN3 को पूरक के रूप में कोशिकाओं में जोड़ा गया।ठंडे पीबीएस के साथ धोने के बाद, कोशिकाओं को स्क्रैप किया गया, 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में एकत्र किया गया, और ईडीटीए के बिना 1x प्रोटीज अवरोधक के साथ पीबीएस के 200 μl में 1 मिनट के लिए एक टिप के साथ sonicated (1 एस और 1 एस बिना, आयाम 35%)।परिणामी मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,871 × जी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था और सतह पर तैरनेवाला एकाग्रता बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करके 1 मिलीग्राम / एमएल में समायोजित किया गया था।उपरोक्त lysate के लगभग 50 µ l को 0.1 mM rhodamine azide (अलादीन, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA लिगैंड, और 1 mM CuSO4 के साथ कमरे के तापमान पर नीचे से ऊपर की ओर रोटेशन के साथ जोड़ा गया था।क्लिक प्रतिक्रिया के बाद, एसीटोन के साथ वर्षा पूर्व-ठंडा एसीटोन के 250 μl को नमूनों में जोड़कर, 20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6010 × जी पर सेंट्रीफ्यूगिंग करके किया गया था।95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1x Laemmli के बफर के 50 μl में गोली ले लीजिए और उबाल लें।नमूने का विश्लेषण एसडीएस-पेज लॉन्ग जैल पर किया गया और इमेज लैब टच सॉफ्टवेयर के साथ बायो-रेड केमीडॉक एमपी टच इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके कल्पना की गई।
पुनः संयोजक मिनीSOG-6xHis प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि पहले वर्णित रूप में की गई थी।संक्षेप में, ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं (TransGen, #CD701-02) को PET21a-miniSOG-6xHis के साथ रूपांतरित किया गया और प्रोटीन अभिव्यक्ति को 0.5 mM IPTG (सैंगोन, # A600168) से प्रेरित किया गया।सेल लसीका के बाद, प्रोटीन को Ni-NTA agarose मोती (MCE, संख्या 70666) का उपयोग करके शुद्ध किया गया, पीबीएस के खिलाफ डायल किया गया, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया।
इन विट्रो लेबल निकटता परख में एक एंटीबॉडी-आधारित के लिए, पीबीएस में 50 μl की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में 100 μM शुद्ध मिनीएसओजी, 1 मिमी जांच 3, और 1 μg एंटी-लेबल माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (ट्रांसजेन, #HT501-01) मिलाएं।.प्रतिक्रिया मिश्रण को कमरे के तापमान पर 0, 2, 5, 10 और 20 मिनट के लिए नीली एलईडी लाइट से विकिरणित किया गया था।मिश्रण को 0.1 मिमी बायोटिन-पीईजी 3-एज़ाइड (अलादीन, # बी122225), 1 मिमी टीसीईपी, 0.1 मिमी टीबीटीए लिगैंड, और 1 मिमी CuSO4 के साथ कमरे के तापमान पर ऊपर की ओर गति वाले शेकर पर लगाया गया था।स्नैप रिएक्शन के बाद, मिश्रण में सीधे 4x लेम्मली का बफर डालें और 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए उबाल लें।एसडीएस-पेज जैल पर नमूनों का विश्लेषण किया गया और स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी (1:1000, सोलरबायो, #SE068) के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया।
सी-टर्मिनल संशोधन (LHDALDAK-CONH2) के साथ एक हिस्टिडीन युक्त सिंथेटिक पेप्टाइड का उपयोग इन विट्रो लेबलिंग में पास के पेप्टाइड-आधारित का विश्लेषण करने के लिए किया गया था।इस परख में, 100 μM शुद्ध मिनीएसओजी, 10 मिमी जांच 3 और 2 μg / ml सिंथेटिक पेप्टाइड को पीबीएस में 50 μl की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में मिलाया गया था।प्रतिक्रिया मिश्रण को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए नीली एलईडी लाइट से विकिरणित किया गया था।एलसी-एमएस सिस्टम (वाटर्स, SYNAPT XS आयनों मोबिलिटी टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमीटर मासलिंक्स स्पेक्ट्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ) का उपयोग करके नमूने के एक माइक्रोलीटर का विश्लेषण किया गया था।
मिनीएसओजी फ्यूजन जीन को स्पष्ट रूप से व्यक्त करने वाली HEK293T कोशिकाओं को विभिन्न ऑर्गेनेल स्थानीयकरण (मिटो, ईआर, न्यूक्लियस) के साथ लाइनों के लिए 10 सेमी व्यंजन और पार्किन-मिनीएसओजी और बीआरडी 4-मिनीएसओजी लाइनों के लिए 15 सेमी व्यंजन में बीज दिया गया था।~ 90% संगम पर पहुंचने पर, कोशिकाओं को एक बार HBSS से धोया गया, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए HBSS में जांच 3 के साथ ऊष्मायन किया गया और कमरे के तापमान पर 10 W नीली एलईडी से रोशन किया गया।पार्किन के गैर-संपर्क लेबलिंग के लिए, एचबीएसएस में जांच 3 के साथ 10 माइक्रोन प्रोटॉन कार्बोनिल साइनाइड वाहक एम-क्लोरोफेनिलहाइड्राज़ोन सीसीसीपी (सोलरबियो, # सी 6700) को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए जोड़ा गया था।सेल लिसिस, क्लिक केमिस्ट्री, रिडक्शन और एल्केलेशन स्टेप्स ऊपर बताए अनुसार समान थे, सिवाय इसके कि 2 मिलीग्राम लाइसेट जोड़ा गया था और बायोटिन PEG3 एज़ाइड का उपयोग फोटोडिग्रेडेबल बायोटिन एज़ाइड के बजाय क्लिक रिएक्शन में किया गया था।संवर्धन के बाद, मोतियों को 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ 0.2% एसडीएस के साथ 3 बार धोया गया, 3 बार पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ 1 एम यूरिया और 3 बार पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ धोया गया।इसके बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रोटीन को साफ करने के लिए 1 एम यूरिया युक्त 300 μl 25 मिमी एबीसी में 2 माइक्रोग्राम ट्रिप्सिन जोड़ा गया।2-3 के पीएच तक पहुंचने तक फॉर्मिक एसिड जोड़कर प्रतिक्रिया रोक दी गई थी।मोतियों पर ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद, पेप्टाइड घोल को SOLAµ HRP कॉलम (थर्मो, #60209-001) का उपयोग करके डिसेल्टेड किया गया और स्पीडवैक वैक्यूम कंसंट्रेटर में सुखाया गया।पेप्टाइड्स को 0.1% फॉर्मिक एसिड में फिर से भंग कर दिया गया था और ऊपर वर्णित नैनो-ईएसआई स्रोत से लैस ऑर्बिट्रैप फ्यूजन लुमोस ट्राइब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके 500 एनजी पेप्टाइड्स का विश्लेषण किया गया था।पेप्टाइड्स को वाणिज्यिक आरपी-एचपीएलसी प्रीकॉलम (75 माइक्रोन x 2 सेमी) (थर्मो, नंबर 164946) और विश्लेषणात्मक आरपी-एचपीएलसी कॉलम (75 माइक्रोन x 25 सेमी) (थर्मो, नंबर 164941) पर अलग किया गया था, दोनों 2 माइक्रोन से भरे हुए थे।60 मिनट में 8% से 35% एसीएन, फिर 300 Nl/मिनट की प्रवाह दर पर 6 मिनट में रैखिक रूप से 98% B तक बढ़ गया।MS स्पेक्ट्रा (350-1500 m/z) 60,000, AGC 4 × 105, और 50 ms के अधिकतम इनपुट समय के संकल्प के साथ एकत्र किए गए थे।चयनित आयनों को एचसीडी द्वारा 3 एस चक्रों में 30% की सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा, 1.6 मीटर/जेड की चौगुनी अलगाव खिड़की और 15000 के एक संकल्प के साथ क्रमिक रूप से खंडित किया गया था। एक 5 × 104 अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमीटर एजीसी लक्ष्य और अधिकतम इंजेक्शन समय 22 एमएस का उपयोग किया गया था।डायनामिक बहिष्करण 45 सेकंड पर सेट है। असाइन नहीं किए गए आयन या 1+ और>7+ के चार्ज वाले लोगों को MS/MS के लिए अस्वीकार कर दिया गया था। असाइन नहीं किए गए आयन या 1+ और>7+ के चार्ज वाले लोगों को MS/MS के लिए अस्वीकार कर दिया गया था। еназначенные ион или ионы с арядом 1+ и >7+ ли отклонены ля /МС. MS/MS के लिए 1+ और >7+ के चार्ज वाले अनसाइन्ड आयन या आयन अस्वीकार कर दिए गए थे।未指定的离子或电荷为1+ >7+ एमएस/एमएस。未指定的离子或电荷为1+ >7+ एमएस/एमएस。 еуказанные ионы или ионы с арядами 1+ и >7+ ли отклонены ля /МС. MS/MS के लिए 1+ और >7+ के अनिर्दिष्ट आयनों या आयनों को अस्वीकार कर दिया गया था।
न्यूट्रएविडिन मोतियों के संवर्धन के लिए नमूना तैयार करने के चरण ऊपर वर्णित एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के समान थे।लोडिंग नियंत्रण के लिए इनपुट के रूप में लगभग 50 μg lysate का उपयोग किया गया था और 2 mg lysate का उपयोग क्लिक प्रतिक्रियाओं के लिए किया गया था।न्यूट्रैविडिन के साथ संवर्धन और धोने के बाद, बाध्य प्रोटीनों को लेम्मली के बफर के 50 μl को agarose राल मोतियों में जोड़कर और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालकर eluted किया गया था।नियंत्रण लोड इनपुट और मनका समृद्ध नमूनों का विश्लेषण एसडीएस-पेज द्वारा किया गया था और मानक पश्चिमी धब्बा विधियों द्वारा पीवीडीएफ झिल्ली (मिलिपोर, # ISEQ00010) में स्थानांतरित किया गया था।झिल्ली को 5% स्किम दूध (सैंगोन, # A600669) के साथ TBS में 0.1% ट्वीन -20 (TBST) युक्त अवरुद्ध किया गया था और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ क्रमिक रूप से ऊष्मायन किया गया था।प्राथमिक एंटीबॉडी को टीबीएसटी में 5% स्किम दूध में 1:1000 पतला किया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ऊष्मायन किया गया।द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग 1:5000 के अनुपात में किया गया और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया।केमिडोक एमपी इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके केमिलुमिनेसिसेंस द्वारा झिल्लियों की कल्पना की गई थी।अंजीर में ब्लॉट्स और जैल के सभी बिना काटे स्कैन को कच्चे डेटा के रूप में प्रस्तुत किया जाता है।
इस अध्ययन में प्रयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी में खरगोश विरोधी SFPQ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (CST, संख्या 71992), खरगोश विरोधी FUS मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (CST, संख्या 67840), खरगोश विरोधी NSUN2 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (प्रोटीनटेक, संख्या 20854-1-) शामिल हैं। AP), खरगोश विरोधी mSin3A पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (Abcam, #ab3479), माउस एंटी-टैग मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (ट्रांसजेन, #HT201-02), माउस एंटी-बीटा-एक्टिन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (ट्रांसजेन, #HC201-01), खरगोश विरोधी -CDK2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (ABक्लोनल, #A0094), CTBP1 के लिए खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (ABक्लोनल, #A11600), DUT के लिए खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (ABक्लोनल, #A2901), PSMC4 के लिए खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (ABक्लोनल, #A2505), खरगोश विरोधी- DNAJB1 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (ABक्लोनल, # A5504)।टीबीएसटी में 5% स्किम दूध में 1:1000 कमजोर पड़ने पर इन एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था।इस अध्ययन में प्रयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी में 1:5000 कमजोर पड़ने पर एंटी-खरगोश IgG (TransGen, #HS101-01), एंटी-माउस IgG (TransGen, #HS201-01) शामिल थे।
आगे की जांच करने के लिए कि क्या BRD4 SFPQ के साथ इंटरैक्ट करता है, स्थिर HEK293T और BRD4-miniSOG कोशिकाओं को HEK293T को ओवरएक्सप्रेस करते हुए 10 सेमी व्यंजन में चढ़ाया गया।कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस से धोया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए EDTA मुक्त प्रोटीज अवरोधक के साथ 1 मिलीलीटर पियर्स आईपी लिसीज़ बफर (थर्मो फिशर, # 87787) में लाइस किया गया।उसके बाद, lysates को 1.5 मिली सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एकत्र किया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,871 xg पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।सतह पर तैरनेवाला काटा गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 5 माइक्रोग्राम एंटी-वी 5 लेबल वाले माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (सीएसटी, # 80076) के साथ ऊष्मायन किया गया।लगभग 50 μl प्रोटीन ए/जी चुंबकीय मोती (एमसीई, # एचवाई-K0202) दो बार पीबीएस के साथ 0.5% के बीच -20 युक्त धो लें।तब सेल lysates चुंबकीय मोतियों के साथ 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे से ऊपर तक रोटेशन के साथ ऊष्मायन किया गया था।फिर मोतियों को 1 मिली पीबीएसटी बफर से चार बार धोया गया और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबाला गया।एसडीएस-पेज जैल पर नमूनों का विश्लेषण किया गया और मानक पश्चिमी धब्बा विधियों का उपयोग करके पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित किया गया।टीबीएसटी में झिल्ली को 5% स्किम दूध में अवरुद्ध किया गया था और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ क्रमिक रूप से ऊष्मायन किया गया था।प्राथमिक एंटीबॉडी रैबिट एंटी-एसएफपीक्यू मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (सीएसटी, #71992) का उपयोग टीबीएसटी में 5% स्किम दूध में 1:1000 के अनुपात में किया गया था और रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था।एंटी-खरगोश आईजीजी का उपयोग 1:5000 के अनुपात में किया गया और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया।केमिडोक एमपी इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके केमिलुमिनेसिसेंस द्वारा झिल्लियों की कल्पना की गई थी।
सॉल्वेंट एक्सेसिबल सरफेस एरिया (एसएएसए) विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली सभी संरचनाएं प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) 52 या अल्फाफोल्ड प्रोटीन संरचना डेटाबेस 53 से प्राप्त की गई थीं।फ्रीसासा कार्यक्रम का उपयोग करके प्रत्येक अवशेष के लिए पूर्ण एसएएसए की गणना की गई थी।लेबल किए गए हिस्टिडीन और उसके पड़ोसियों के लिए केवल पूर्ण और स्पष्ट एसएएसए डेटा का उपयोग प्रत्येक संरचना के लिए औसत एसएएसए प्राप्त करने के लिए किया गया था।प्रत्येक हिस्टिडीन के लिए सापेक्ष विलायक अभिगम्यता (आरएसए) की गणना विलायक के लिए उपलब्ध अनुभवजन्य अधिकतम संभव अवशेष सतह क्षेत्र द्वारा पूर्ण एसएएसए मूल्य को विभाजित करके की गई थी।सभी हिस्टिडाइन को तब छिपे हुए के रूप में वर्गीकृत किया गया था यदि औसत आरएसए 20% से कम था, अन्यथा उजागर 56।
डीडीए मोड में प्राप्त कच्ची फाइलों को सामान्य संदूषकों वाले उपयुक्त स्विसप्रोट सत्यापित प्रोटीन डेटाबेस में प्रोटिओम डिस्कवरर (v2.5) या एमएसफ्रैगर (फ्रैगपाइप v15.0) का उपयोग करके खोजा गया था।पेप्टाइड्स को दो लापता दरार स्थलों के साथ पूर्ण ट्रिप्सिन की आवश्यकता होती है, एक निश्चित संशोधन के रूप में कार्बामॉयल मिथाइलेशन और एक गतिशील संशोधन के रूप में मेथियोनीन ऑक्सीकरण।अग्रदूत और टुकड़ा वजन सहनशीलता क्रमशः 10 पीपीएम और 0.02 डीए (एमएस 2 ऑर्बिट्रैप) पर सेट की गई थी। दूषित हिट को हटा दिया गया था, और <1% की झूठी खोज दर प्राप्त करने के लिए प्रोटीन को फ़िल्टर किया गया था। दूषित हिट को हटा दिया गया था, और <1% की झूठी खोज दर प्राप्त करने के लिए प्रोटीन को फ़िल्टर किया गया था। опадания агрязняющих веществ ли ​​удалены, а белки отфильтрованы, тобы олучить коэффициент лобного . दूषित हिट को हटा दिया गया और प्रोटीन को <1% की झूठी पहचान दर देने के लिए फ़िल्टर किया गया।<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 опадания агрязняющих веществ ли ​​удалены, а белки отфильтрованы ля остижения уровня ложных обнаруж। दूषित हिट को हटा दिया गया और प्रोटीन को <1% की झूठी सकारात्मक दर प्राप्त करने के लिए फ़िल्टर किया गया।लेबल के उपयोग के बिना मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, तीन जैविक दोहराव से सामान्यीकृत प्रोटीन सामग्री का उपयोग किया गया था।प्रोटीन उप-कोशिकीय स्थानीयकरण विश्लेषण डेविड बायोइनफॉरमैटिक्स रिसोर्सेज, माइटोकार्टा 3.0 और एलिस टिंग समूह द्वारा संकलित और प्रकाशित डेटाबेस से जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था।ज्वालामुखी का नक्शा पर्सियस (v1.6.15.0) से प्राप्त किया गया था। दो-तरफा टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व के लिए प्रोटीन बहुतायत गुना परिवर्तनों का परीक्षण किया गया था, और प्रोटीन हिट की पहचान बहुतायत परिवर्तन> 2 (जब तक कि अन्यथा नहीं कहा गया) और पी मान <0.05 के साथ की गई थी। दो-तरफा टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व के लिए प्रोटीन बहुतायत गुना परिवर्तनों का परीक्षण किया गया था, और प्रोटीन हिट की पहचान बहुतायत परिवर्तन> 2 (जब तक कि अन्यथा नहीं कहा गया) और पी मान <0.05 के साथ की गई थी। Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व के लिए प्रोटीन सामग्री गुना परिवर्तनों का परीक्षण किया गया था, और प्रोटीन मैचों की पहचान सामग्री परिवर्तन> 2 (जब तक कि अन्यथा नोट नहीं किया गया) और एपी मान <0.05 के साथ की गई थी।t > 2（除非另有说明）和p 值<0.05。टी 检验 变化> 2 和 पी 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. प्रोटीन सामग्री में गुना परिवर्तन के सांख्यिकीय महत्व को दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग करके परीक्षण किया गया था, और प्रोटीन मिलान सामग्री परिवर्तन> 2 (जब तक कि अन्यथा संकेत नहीं दिया गया) और पी-मान <0.05 के लिए निर्धारित किया गया था।स्ट्रिंग डेटाबेस के साथ GO विश्लेषण का उपयोग करके प्रोटीन इंटरैक्शन विश्लेषण किया गया था।
इसी तरह के परिणामों के साथ तीन जैविक प्रतिकृति की गई।सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर) के साथ किया गया था और ज्वालामुखी भूखंडों को पर्सियस (v1.6.15.0) के साथ उत्पन्न किया गया था।दो समूहों की तुलना करने के लिए, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके पी-मान निर्धारित किए गए थे।प्रयोगात्मक समूह में कम से कम दो बार पहचाने जाने वाले सिंगलटन प्रोटीन को ज्वालामुखी भूखंडों में शामिल किया गया था, और नियंत्रण समूह में संबंधित लापता मूल्यों को सामान्य वितरण से पर्सियस के साथ बदल दिया गया था ताकि पी-मान की गणना की जा सके।त्रुटि पट्टियाँ माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं।सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रोटिओमिक विश्लेषण में, कम से कम दो जैविक प्रतिकृति में दिखाई देने वाले प्रोटीन की प्रचुरता को बरकरार रखा गया था।नमूना आकार को पूर्व-निर्धारित करने के लिए सांख्यिकीय विधियों का उपयोग नहीं किया गया था।प्रयोग यादृच्छिक नहीं हैं।परिणामों के प्रयोग और मूल्यांकन के दौरान शोधकर्ता कार्यों के प्रति अंधे नहीं थे।
अध्ययन डिजाइन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, इस आलेख से जुड़ी प्रकृति अनुसंधान रिपोर्ट सार देखें।
इस अध्ययन में प्राप्त मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा डेटासेट आईडी PXD034811 (PDPL-MS डेटासेट) के तहत iProX57 पार्टनर रिपॉजिटरी के माध्यम से ProteomeXchange Consortium को प्रस्तुत किया गया था।कच्चे डेटा कच्चे डेटा फ़ाइलों के रूप में प्रदान किए जाते हैं।यह आलेख मूल डेटा प्रदान करता है।
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