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संक्रामक रोगों का पता लगाने के लिए पारंपरिक नैदानिक ​​रणनीतियों के लिए बेंचटॉप उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता होती है जो पॉइंट-ऑफ-केयर परीक्षण (पीओसीटी) के लिए उपयुक्त नहीं हैं।उभरता हुआ माइक्रोफ्लुइडिक्स एक अत्यधिक लघु, स्वचालित और एकीकृत तकनीक है जो तेज, कम लागत वाली, सटीक ऑन-साइट डायग्नोस्टिक्स के लिए पारंपरिक तरीकों का एक संभावित विकल्प है।रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए सबसे प्रभावी तरीकों के रूप में माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में आणविक निदान विधियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।यह समीक्षा अकादमिक और औद्योगिक दोनों दृष्टिकोणों से संक्रामक रोगों के माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित आणविक निदान में हाल की प्रगति का सार प्रस्तुत करती है।सबसे पहले, हम न्यूक्लिक एसिड के एक विशिष्ट ऑन-चिप प्रसंस्करण का वर्णन करते हैं, जिसमें नमूना प्रीट्रीटमेंट, प्रवर्धन और सिग्नल रीडिंग शामिल हैं।फिर चार प्रकार के माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों की विशेषताओं, फायदे और नुकसान की तुलना की जाती है।अगला, हम न्यूक्लिक एसिड की पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए डिजिटल परख के उपयोग पर चर्चा करेंगे।शास्त्रीय और हाल ही में वाणिज्यिक माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित आणविक नैदानिक ​​उपकरणों दोनों को बाजार की वर्तमान स्थिति के प्रमाण के रूप में संक्षेपित किया गया है।अंत में, हम संक्रामक रोगों के माइक्रोफ्लुइडिक निदान के लिए भविष्य के निर्देशों का प्रस्ताव करते हैं।
संक्रामक रोग रोगजनकों के कारण होते हैं, जिनमें बैक्टीरिया, वायरस और परजीवी शामिल हैं, जो दुनिया भर में वितरित किए जाते हैं।अन्य बीमारियों के विपरीत, रोगजनक जल्दी से संक्रमित हो जाते हैं और मनुष्यों और मेजबान जानवरों के बीच टीकाकरण, वायु और जल मीडिया [1] के माध्यम से फैल जाते हैं।सार्वजनिक स्वास्थ्य उपाय के रूप में संक्रामक रोग की रोकथाम महत्वपूर्ण है।संक्रामक रोगों से निपटने के लिए तीन मुख्य रणनीतियाँ: (1) संक्रमण के स्रोत को नियंत्रित करना;(2) संचरण पथ में रुकावट;(3) अतिसंवेदनशील आबादी की सुरक्षा।मुख्य रणनीतियों में संक्रमण के स्रोत पर नियंत्रण को इसकी सुविधा और कम लागत के कारण सबसे महत्वपूर्ण रणनीति माना जाता है।संक्रमित व्यक्तियों का तेजी से निदान, अलगाव और उपचार महत्वपूर्ण है, इसके लिए तेज, संवेदनशील और सटीक निदान रणनीतियों की आवश्यकता होती है [2]।संक्रामक रोगों का वर्तमान निदान आमतौर पर संकेतों और लक्षणों और प्रयोगशाला अध्ययनों जैसे सेल संस्कृति और आणविक निदान के आधार पर नैदानिक ​​​​परीक्षा को जोड़ता है, जिसके लिए प्रशिक्षित कर्मियों, श्रम-गहन प्रक्रियाओं और महंगे परीक्षण उपकरण [3, 4] की आवश्यकता होती है।संक्रामक रोग के प्रकोप की रोकथाम के लिए तेजी से, सस्ते और सटीक स्थानीय निदान की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से संसाधन-सीमित क्षेत्रों में जहां संक्रामक रोग आम और गंभीर होते हैं [5], साथ ही जंगल में या युद्ध के मैदान में उपचार, जहां आपात स्थिति अप्रत्याशित होती है।.चिकित्सा देखभाल सीमित है [6]।इस संदर्भ में, माइक्रोफ्लुइडिक्स एक ऐसी तकनीक है जो सटीक द्रव हेरफेर [7,8,9,10] के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम टेक्नोलॉजी, नैनोटेक्नोलॉजी या सामग्री विज्ञान को जोड़ती है, जो पॉइंट-ऑफ-केयर डिटेक्शन (पीओसीटी) के लिए नई संभावनाएं प्रदान करती है।) अस्पतालों और प्रयोगशालाओं के बाहर संक्रामक एजेंट।पारंपरिक समय लेने वाली निदान की तुलना में, माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक रोग के प्रकोप के दौरान आणविक निदान के लिए नमूना और लागत बचत प्रदान करती है।कोरोनावायरस रोग 2019 (COVID-19) का वैश्विक प्रसार गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2) के कारण होता है, इसलिए महामारी की समय पर रोकथाम और नियंत्रण के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स के महत्व पर फिर से जोर दिया जाता है [11, 12 , 13]।पारंपरिक डायग्नोस्टिक्स के विपरीत, माइक्रोफ्लुइडिक पीओसीटी नमूना बिंदु के पास परीक्षण करने के लिए बेंचटॉप एनालाइज़र से लेकर छोटे साइडस्ट्रीम टेस्ट स्ट्रिप्स तक के छोटे पोर्टेबल उपकरणों का उपयोग करता है।इन परीक्षणों में सरल या बिना नमूना तैयार करने, तेज सिग्नल प्रवर्धन और संवेदनशील सिग्नल रीडिंग की सुविधा होती है जिसके परिणामस्वरूप कम अवधि और मिनटों में सटीक परिणाम मिलते हैं।माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित स्वास्थ्य देखभाल उपकरणों की उपलब्धता और बड़े पैमाने पर उत्पादन ने अस्पताल के बाहर, रोगी के पास और यहां तक ​​कि घर पर भी उनके लागत प्रभावी और प्रत्यक्ष नैदानिक ​​​​अनुप्रयोगों का विस्तार किया है।
संक्रामक रोगों के निदान के लिए मौजूदा रणनीतियों में, आणविक निदान सबसे संवेदनशील [15, 16] में से एक है।इसके अलावा, आणविक निदान को अक्सर COVID-19 के निरंतर पता लगाने के लिए सोने के मानक के रूप में उपयोग किया जाता है, जिससे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शुरुआत से पहले आरएनए या डीएनए के वायरस-विशिष्ट क्षेत्रों का प्रत्यक्ष पता लगाने की अनुमति मिलती है [17, 18]।वर्तमान समीक्षा में, हम संक्रामक रोगों के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित आणविक नैदानिक ​​प्रक्रियाओं में नवीनतम प्रगति प्रस्तुत करते हैं, शैक्षणिक दृष्टिकोण से भविष्य के औद्योगिक दृष्टिकोण (चित्र 1) तक।हम न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन में तीन प्रमुख चरणों के साथ शुरू करेंगे: ऑन-चिप सैंपल प्रीट्रीटमेंट, न्यूक्लिक एसिड एम्प्लीफिकेशन और सिग्नल रीडिंग।हमने तब विभिन्न प्रकार के माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों की तुलना उनकी संरचना और कार्य के साथ की, जिसमें अद्वितीय विशेषताओं (ताकत और कमजोरियां) दिखाई दे रही थीं।डिजिटल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने पर आगे चर्चा की जाती है और संक्रामक रोगजनक अणुओं की पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए तीसरी पीढ़ी की तकनीक के उदाहरण के रूप में दिया जाता है।इसके अलावा, आणविक निदान के लिए माइक्रोफ्लुइडिक पीओसीटी बाजार की वर्तमान स्थिति को प्रदर्शित करने के लिए कई विशिष्ट और नवीनतम वाणिज्यिक पीओसीटी उपकरणों को प्रस्तुत किया जाएगा।हम भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए अपने दृष्टिकोण पर भी चर्चा और व्याख्या करेंगे।
न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के मॉड्यूल को उनके कार्यों के अनुसार तीन श्रेणियों (नमूनाकरण, मान्यता और सिग्नलिंग) में विभाजित किया जा सकता है [19]।इन मॉड्यूलों में, नमूनाकरण मॉड्यूल मुख्य रूप से नमूना विश्लेषण और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण का एहसास करता है।सेंसर मॉड्यूल मुख्य रूप से न्यूक्लिक एसिड संकेतों के रूपांतरण और प्रवर्धन को नियंत्रित करता है।सिग्नलिंग मॉड्यूल सेंसिंग मॉड्यूल द्वारा परिवर्तित और संसाधित सिग्नल का पता लगाता है।एक चिप पर न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की प्रक्रिया के आधार पर, हम विभिन्न चिप्स को संक्षेप में प्रस्तुत करेंगे जो "इनपुट और आउटपुट" फ़ंक्शन का एहसास कर सकते हैं।
न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में पहला कदम न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण है, यानी मूल नमूने से लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड को अलग करना।न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण अन्य आणविक संदूषकों से न्यूक्लिक एसिड को शुद्ध करने, न्यूक्लिक एसिड अणुओं की प्राथमिक संरचना की अखंडता सुनिश्चित करने और परिणामों को अनुकूलित करने के लिए किया जाता है।न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए आवश्यक नमूना विश्लेषण और न्यूक्लिक एसिड कैप्चर की आवश्यकता होती है, जिसकी गुणवत्ता और दक्षता का अनुसंधान और नैदानिक ​​परिणामों पर बहुत अधिक प्रभाव पड़ता है।निष्कर्षण के दौरान कोई भी सूक्ष्म दुष्प्रभाव आगे की पहचान को सीमित कर सकता है।उदाहरण के लिए, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और लूप इज़ोटेर्मल एम्प्लीफिकेशन (एलएएमपी) तरीके कुछ अवशिष्ट कार्बनिक सॉल्वैंट्स जैसे इथेनॉल और आइसोप्रोपेनॉल द्वारा न्यूक्लिक एसिड आइसोलेशन अभिकर्मकों [20] में बाधित होते हैं।तरल-तरल निष्कर्षण और ठोस-चरण निष्कर्षण न्यूक्लिक एसिड [21] को अलग करने के लिए सबसे लोकप्रिय तरीके हैं, हालांकि, एक चिप पर तरल-तरल निष्कर्षण बेहद सीमित है, क्योंकि तरल-तरल निष्कर्षण में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक अधिकांश माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के क्षरण का कारण बनते हैं। .यहां, हम माइक्रोएरे-आधारित ठोस चरण निष्कर्षण विधियों पर प्रकाश डालते हैं और उनके फायदे और नुकसान की तुलना करते हैं।
सिलिकॉन एक सब्सट्रेट सामग्री है जो इसकी जैव-अनुकूलता, स्थिरता और संशोधन में आसानी के कारण न्यूक्लिक एसिड के साथ संगत है [22]।महत्वपूर्ण रूप से, जब सिलिका या अन्य सामग्रियों के साथ संशोधित किया जाता है, तो यह मिश्रित उच्च पीएच, कम नमक समाधान के साथ कम पीएच, उच्च नमक स्थितियों के तहत नकारात्मक चार्ज न्यूक्लिक एसिड को सोखने के गुणों को प्रदर्शित करता है।इस घटना के आधार पर, न्यूक्लिक एसिड को शुद्ध करना संभव है।
माइक्रोफ्लुइडिक्स में न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए सिलिका-आधारित सामग्रियों के विभिन्न रूपों का उपयोग किया गया है, जैसे सिलिका मोती, पाउडर, माइक्रोफाइबर फिल्टर, और सिलिका झिल्ली [23, 24, 25, 26]।सामग्री के गुणों के आधार पर, सिलिकॉन-आधारित सामग्री का उपयोग विभिन्न तरीकों से माइक्रोक्रिकिट्स में किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, सिलिका ग्रैन्यूल्स, पाउडर और वाणिज्यिक नैनोफिल्टर को केवल माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के छिद्रों या माइक्रोचैनल में रखा जा सकता है और नमूनों से न्यूक्लिक एसिड निकालने में मदद करता है [27, 28, 29]।सतह-संशोधित सिलिका झिल्ली का उपयोग कम लागत पर रोगजनकों से डीएनए को तेजी से शुद्ध करने के लिए भी किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, वांग एट अल।[30] चिटोसन ओलिगोसेकेराइड्स के साथ लेपित सिलिका झिल्ली के साथ पुटिका-मध्यस्थ श्रृंखला विनिमय के साथ प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं को जोड़कर, एक बहुमुखी पोर्टेबल प्रणाली पेश की गई जिसने 102-108 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों का सफलतापूर्वक पता लगाया।(सीएफयू)/एमएल विब्रियो पैराहामोलिटिकस।, और वायरस की उपस्थिति आसानी से दिखाई दे रही थी।पॉवेल एट अल।[31] सिलिकॉन-आधारित माइक्रोएरे का उपयोग तब हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी), मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी), जीका वायरस और मानव पेपिलोमावायरस और स्वचालित प्रसार का पता लगाने के लिए किया गया था, जिसमें आरएनए वायरस को पकड़ने के लिए 1.3 μl कपटपूर्ण माइक्रोरिएक्टर विकसित किया गया था।और स्वस्थानी प्रवर्धन में प्रदर्शन करें।इन विधियों के अलावा, सतह-संशोधित सिलिका माइक्रोकॉलम भी न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, क्योंकि संशोधित सामग्री की ज्यामिति और गुण निष्कर्षण दक्षता में काफी वृद्धि करते हैं।चेन एट अल।[32] अमीनो-लेपित सिलिकॉन माइक्रोकॉलम के आधार पर कम सांद्रता वाले आरएनए के अलगाव के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का प्रस्ताव रखा।यह माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस एक उच्च सतह क्षेत्र से वॉल्यूम अनुपात डिजाइन के माध्यम से उच्च निष्कर्षण दक्षता प्राप्त करने के लिए एक सिलिकॉन सब्सट्रेट पर 0.25 सेमी 2 माइक्रोप्रिलर की एक सरणी को एकीकृत करता है।इस डिजाइन का लाभ यह है कि माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 95% तक न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण दक्षता प्राप्त कर सकता है।ये सिलिकॉन-आधारित रणनीतियां कम लागत पर तेजी से अलग करने वाले न्यूक्लिक एसिड के मूल्य को प्रदर्शित करती हैं।माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के संयोजन में, सिलिकॉन-आधारित निष्कर्षण रणनीतियाँ न केवल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की दक्षता को बढ़ा सकती हैं, बल्कि विश्लेषणात्मक उपकरणों के लघुकरण और एकीकरण की सुविधा भी प्रदान कर सकती हैं [20]।
चुंबकीय पृथक्करण विधियां बाहरी चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में न्यूक्लिक एसिड को अलग करने के लिए चुंबकीय कणों का उपयोग करती हैं।आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले चुंबकीय कणों में सिलिका, अमीनो और कार्बोक्सिल [33,34,35,36] के साथ लेपित Fe3O4 या γ-Fe2O3 चुंबकीय कण शामिल हैं।सिलिकॉन-आधारित एसपीई विधियों की तुलना में चुंबकीय कणों की विशिष्ट विशेषता बाहरी चुम्बकों के साथ हेरफेर और नियंत्रण में आसानी है।
न्यूक्लिक एसिड और सिलिका के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन का उपयोग करते हुए, उच्च नमक और कम पीएच की स्थितियों के तहत, न्यूक्लिक एसिड सिलिका-लेपित चुंबकीय कणों की सतह पर सोख लिए जाते हैं, जबकि कम नमक और उच्च पीएच की स्थितियों में अणुओं को धोया जा सकता है। फिर से।.सिलिका-लेपित चुंबकीय मोती चुंबकीय रूप से नियंत्रित गति [37] का उपयोग करके बड़ी मात्रा के नमूनों (400 μL) से डीएनए निकालना संभव बनाते हैं।एक प्रदर्शन के रूप में, रोड्रिगेज-माटोस एट अल।[38] विभिन्न कक्षों में चुंबकीय मोतियों के स्थानांतरण को नियंत्रित करने के लिए ट्यून करने योग्य चुम्बकों का उपयोग किया।सिलिका-लेपित चुंबकीय कणों के आधार पर, SARS-CoV-2 जीनोमिक RNA की 470 प्रतियां/एमएल अपशिष्ट जल के नमूनों से LAMP रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन डिटेक्शन (RT-LAMP) के लिए निकाली जा सकती हैं और प्रतिक्रिया को 1 घंटे के भीतर पढ़ा जा सकता है।नग्न आंखों (चित्र। 2 ए)।
चुंबकीय और झरझरा सामग्री पर आधारित उपकरण।SARS-CoV-2 RNA का पता लगाने के लिए IFAST RT-LAMP माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का वैचारिक आरेख ([38] से अनुकूलित)।b बुक्कल स्वैब न्यूक्लिक एसिड के dSPE के लिए सेंट्रीफ्यूगल माइक्रो डिवाइस ([39] से अनुकूलित)।c एक FTA® कार्ड ([50] से अनुकूलित) का उपयोग करके निर्मित स्व-संचालित नमूना सांद्रक।डी फ्यूजन 5 फिल्टर पेपर को चिटोसन के साथ संशोधित किया गया ([51] से अनुकूलित)।SARS-CoV-2 गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2, RT-LAMP रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन लूप मध्यस्थता इज़ोटेर्मल एम्प्लीफिकेशन, FTA फ़ाइंडर्स टेक्नोलॉजी पार्टनर, NA न्यूक्लिक एसिड
धनावेशित चुंबकीय कण न्यूक्लिक एसिड के फॉस्फेट बैकबोन को जोड़ने के लिए आदर्श होते हैं।नमक की एक निश्चित सांद्रता पर, न्यूक्लिक एसिड के नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए फॉस्फेट समूहों को चुंबकीय मिश्रित कणों की सतह पर सकारात्मक रूप से चार्ज किया जा सकता है।इसलिए, न्यूक्लिक एसिड के निष्कर्षण के लिए खुरदरी सतह और अमीनो समूहों के उच्च घनत्व वाले चुंबकीय नैनोकणों को विकसित किया गया था।चुंबकीय पृथक्करण और अवरोधन के बाद, चुंबकीय नैनोकणों और डीएनए परिसरों का सीधे पीसीआर में उपयोग किया जा सकता है, जो जटिल और समय लेने वाली शुद्धि और क्षालन संचालन की आवश्यकता को समाप्त करता है [35]।नकारात्मक कार्बोक्सिल समूहों के साथ लेपित चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग उच्च सांद्रता वाले पॉलीइथाइलीन ग्लाइकॉल और सोडियम क्लोराइड समाधान [36] में सतहों पर अधिशोषित न्यूक्लिक एसिड को अलग करने के लिए भी किया गया है।इन सतह-संशोधित चुंबकीय मोतियों के साथ, डीएनए निष्कर्षण बाद के प्रवर्धन के साथ संगत है।डिग्नन एट अल।[39] न्यूक्लिक एसिड प्रीट्रीटमेंट के लिए एक स्वचालित और पोर्टेबल सेंट्रीफ्यूगल माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का वर्णन किया, जो गैर-तकनीकी कर्मियों को साइट पर इसका उपयोग करने की अनुमति देता है।इसके अलावा, LAMP के साथ पृथक डीएनए की संगतता, बिंदु-की-देखभाल न्यूक्लिक एसिड विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल विधि, वर्णमिति परख (छवि 2 बी) के लिए न्यूनतम उपकरण आवश्यकताओं और उपयुक्तता को प्रदर्शित करती है।
चुंबकीय मनका विधियां स्वचालित निष्कर्षण की संभावना प्रदान करती हैं, जिनमें से कुछ वाणिज्यिक स्वचालित न्यूक्लिक एसिड एक्सट्रैक्टर्स में मौजूद हैं [किंगफिशर;थर्मोफिशर (वॉलथम, एमए, यूएसए), QIAcube® HT;CapitalBio (बीजिंग, चीन) और Biomek®;बेकमैन (मियामी, यूएसए)।), फ्लोरिडा, यूएसए)]।माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ चुंबकीय मोतियों के संयोजन के लाभों का उपयोग न्यूक्लिक एसिड के कुशल स्वचालित निष्कर्षण के लिए किया जा सकता है, जो संभावित रूप से आणविक निदान के विकास को आगे बढ़ा सकता है;हालाँकि, माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ चुंबकीय मोतियों का संयोजन अभी भी चुंबकीय मोतियों के सटीक हेरफेर के लिए जटिल नियंत्रण प्रणालियों पर बहुत अधिक निर्भर करता है, जो वाणिज्यिक उत्पादों की भारी और महंगी होने की व्याख्या करता है, जो POCT में चुंबकीय मोतियों के आगे के अनुप्रयोग को सीमित करता है।
कई झरझरा सामग्री जैसे संशोधित नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्टर, फाइंडर्स टेक्नोलॉजी एसोसिएट्स (एफटीए) कार्ड, पॉलीएथरसल्फोन-आधारित फिल्टर पेपर और ग्लाइकेन-लेपित सामग्री का उपयोग न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए भी किया गया है [40, 41, 42, 43, 44]।रेशेदार कागज जैसे झरझरा रेशेदार पदार्थों का उपयोग पहले डीएनए को अलग करने के लिए किया जाता था, जो फाइबर के साथ लंबे समय से फंसे डीएनए अणुओं को शारीरिक रूप से उलझाता था।छोटे छिद्रों से डीएनए अणुओं का एक मजबूत शारीरिक प्रतिबंध होता है, जो डीएनए निष्कर्षण को सकारात्मक रूप से प्रभावित करता है।रेशेदार कागज के विभिन्न छिद्रों के आकार के कारण, निष्कर्षण दक्षता डीएनए प्रवर्धन [45, 46] की जरूरतों को पूरा नहीं कर सकती है।एफटीए कार्ड एक वाणिज्यिक फिल्टर पेपर है जिसका उपयोग फोरेंसिक चिकित्सा के क्षेत्र में किया जाता है और व्यापक रूप से आणविक निदान के अन्य क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है।नमूने में कोशिका झिल्ली को अलग करने के लिए विभिन्न रसायनों के साथ लगाए गए सेलूलोज़ फिल्टर पेपर के उपयोग के माध्यम से, जारी डीएनए 2 साल तक गिरावट से सुरक्षित रहता है।हाल ही में, SARS-CoV-2, लीशमैनियासिस और मलेरिया [47,48,49] सहित विभिन्न रोगजनकों के आणविक पता लगाने के लिए संसेचित सेल्युलोज पेपर विकसित किया गया है।पृथक प्लाज्मा में एचआईवी सीधे lysed है, और वायरल न्यूक्लिक एसिड सांद्रक में निर्मित FTA® प्रवाह झिल्ली में समृद्ध होता है, जो न्यूक्लिक एसिड [50] (छवि 2c) के कुशल उत्पादन की अनुमति देता है।एफटीए कार्ड का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में मुख्य समस्या यह है कि गुआनिडीन और आइसोप्रोपेनॉल जैसे रसायन बाद के प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं को रोकते हैं।इस समस्या को हल करने के लिए, हमने फ्यूजन 5 चिटोसन-संशोधित फिल्टर पेपर विकसित किया है, जो अत्यधिक कुशल न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्राप्त करने के लिए डीएनए अणुओं और रेशेदार फिल्टर पेपर के भौतिक इंटरलेसिंग और चिटोसन-संशोधित यौगिकों पर डीएनए के इलेक्ट्रोस्टैटिक सोखना दोनों के लाभों को जोड़ता है। ..फिल्टर फाइबर [51] (चित्र 2डी)।इसी तरह, झू एट अल।[52] जीका वायरस आरएनए के तेजी से अलगाव और पता लगाने के लिए एक स्वस्थानी केशिका माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली पर आधारित एक चिटोसन-संशोधित पीसीआर पद्धति का प्रदर्शन किया।chitosan के ऑन/ऑफ स्विच गुण के आधार पर, न्यूक्लिक अम्लों को क्रमशः मिश्रित लाइसेट/पीसीआर माध्यम में अधिशोषित/अवशोषित किया जा सकता है।चालू और बंद", पीएच के लिए उत्तरदायी।
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, ये रणनीतियाँ विभिन्न ठोस चरण सामग्री के लाभों को जोड़ती हैं और माइक्रोफ्लुइडिक्स में न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की दक्षता में वृद्धि करती हैं।व्यावहारिक अनुप्रयोगों में, बड़ी मात्रा में इन सामग्रियों का उपयोग गैर-आर्थिक है, और इन सामग्रियों के साथ सामान्य सामग्री का उचित सतह उपचार या सतह संशोधन भी उनके कार्य को संरक्षित कर सकता है।इसलिए, यह माना जाता है कि एक पायलट अध्ययन के बाद इन रणनीतियों के कार्यान्वयन से लागत कम हो सकती है।
माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों पर न्यूक्लिक एसिड परीक्षण अक्सर छोटे नमूना संस्करणों (<100 μl) का उपयोग करता है, इसलिए डाउनस्ट्रीम डिटेक्शन (ऑप्टिकल, इलेक्ट्रिकल और चुंबकीय) के लिए सुविधाजनक सिग्नल में रूपांतरण के लिए विशिष्ट जांच के साथ लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड के प्रवर्धन की आवश्यकता होती है [53, 54]। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों पर न्यूक्लिक एसिड परीक्षण अक्सर छोटे नमूना संस्करणों (<100 μl) का उपयोग करता है, इसलिए डाउनस्ट्रीम डिटेक्शन (ऑप्टिकल, इलेक्ट्रिकल और चुंबकीय) के लिए सुविधाजनक सिग्नल में रूपांतरण के लिए विशिष्ट जांच के साथ लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड के प्रवर्धन की आवश्यकता होती है [53, 54]। При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों पर न्यूक्लिक एसिड का परीक्षण करते समय, छोटे नमूना वॉल्यूम (<100 μL) का अक्सर उपयोग किया जाता है, इसलिए विशेष जांच के साथ लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड के प्रवर्धन को बाद में पता लगाने (ऑप्टिकल, इलेक्ट्रिकल और चुंबकीय) के लिए सुविधाजनक सिग्नल में परिवर्तित करने की आवश्यकता होती है। [53, 54]।微流控平台上的核酸检测通常使用小样本量（< 100 μl），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号 [53, 54 ]。[53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों पर न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में आमतौर पर छोटे नमूना संस्करणों (<100 μl) का उपयोग किया जाता है, जिसके लिए विशेष जांच के साथ लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड के प्रवर्धन की आवश्यकता होती है ताकि उन्हें बाद में पता लगाने (ऑप्टिकल, इलेक्ट्रिकल और चुंबकीय) के लिए संकेतों में परिवर्तित किया जा सके [53, 54]] .माइक्रोफ्लुइडिक्स में न्यूक्लिक एसिड का प्रवर्धन भी प्रतिक्रियाओं को तेज कर सकता है, पता लगाने की सीमा को अनुकूलित कर सकता है, नमूना आवश्यकताओं को कम कर सकता है और पहचान सटीकता में सुधार कर सकता है [55, 56]।हाल के वर्षों में, तेजी से और सटीक पहचान की प्राप्ति के साथ, माइक्रोफ्लुइडिक्स में विभिन्न न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन विधियों को लागू किया गया है, जिसमें पीसीआर और कुछ इज़ोटेर्मल प्रवर्धन प्रतिक्रियाएं शामिल हैं।यह खंड माइक्रोफ्लुइडिक प्रणालियों के आधार पर न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के तरीकों को संक्षेप में प्रस्तुत करेगा।
पीसीआर एक जीव की डीएनए प्रतिकृति प्रक्रिया का अनुकरण है, जिसके सिद्धांत को अन्यत्र विस्तार से वर्णित किया गया है और यहां इसकी चर्चा नहीं की जाएगी।पीसीआर एक घातीय दर पर लक्ष्य डीएनए/आरएनए की बहुत कम मात्रा को बढ़ा सकता है, जिससे पीसीआर न्यूक्लिक एसिड का तेजी से पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन जाता है।हाल के दशकों में, पॉइंट-ऑफ-केयर डायग्नोस्टिक्स [57, 58] की जरूरतों को पूरा करने के लिए पीसीआर थर्मल साइकलिंग सिस्टम से लैस कई पोर्टेबल माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस विकसित किए गए हैं।विभिन्न तापमान नियंत्रण विधियों [59] के अनुसार ऑन-चिप पीसीआर को चार प्रकारों (पारंपरिक, निरंतर प्रवाह, स्थानिक रूप से स्विच, और संवहनी पीसीआर) में विभाजित किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, जी एट अल।[60] गले के स्वाब नमूनों में SARS-CoV-2, इन्फ्लूएंजा ए और बी वायरस के मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए अपने स्वयं के माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पर एक प्रत्यक्ष रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन क्वांटिटेटिव पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) विधि विकसित की (चित्र 3ए)।पार्क एट अल।[61] पतली फिल्म पीसीआर, इलेक्ट्रोड, और एक उंगली से संचालित पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक मॉड्यूल को एकीकृत करके एक सरल रोगज़नक़ विश्लेषण चिप का निर्माण किया।हालाँकि, दोनों कार्यों में पारंपरिक पीसीआर की सामान्य कमियाँ शामिल हैं।पीसीआर को थर्मल साइकलिंग की आवश्यकता होती है, जो आगे डिवाइस के लघुकरण और कम परीक्षण समय को सीमित करता है।
इस मुद्दे को हल करने के लिए निरंतर प्रवाह आधारित माइक्रोफ्लुइडिक और स्पेस-स्विच्ड पीसीआर का विकास महत्वपूर्ण है।एक लंबे सर्पिन चैनल या एक छोटे सीधे चैनल का उपयोग करते हुए, निरंतर प्रवाह पीसीआर एक ऑफ-चिप पंप के साथ तीन प्रीहीट क्षेत्रों में सक्रिय रूप से परिसंचारी अभिकर्मकों द्वारा तेजी से प्रवर्धन प्रदान कर सकता है।यह ऑपरेशन सफलतापूर्वक विभिन्न प्रतिक्रिया तापमानों के बीच संक्रमण चरण से बचा जाता है और इस प्रकार परीक्षण समय को काफी कम कर देता है [62] (चित्र 3 बी)।जंग एट अल द्वारा एक अन्य अध्ययन में।[63] एक नए रोटरी पीसीआर आनुवंशिक विश्लेषक का प्रस्ताव किया जो अल्ट्राफास्ट और मल्टीप्लेक्स रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (छवि 3 सी) के लिए फिक्स्ड और फ्लो पीसीआर की विशेषताओं को जोड़ता है।न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन के लिए, पीसीआर माइक्रोचिप को अलग-अलग तापमान पर तीन हीटिंग ब्लॉकों के माध्यम से घुमाया जाएगा: 1. विकृतीकरण ब्लॉक 94 डिग्री सेल्सियस, 2. 58 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग ब्लॉक, 3. 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार ब्लॉक।
माइक्रोफ्लुइडिक्स में पीसीआर का अनुप्रयोग।माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पर dirRT-qPCR का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ([60] से अनुकूलित)।ख एक सर्पीन चैनल पर आधारित एक सतत प्रवाह पीसीआर माइक्रोएरे का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ([62] से अनुकूलित)।c एक रोटरी पीसीआर आनुवंशिक विश्लेषक का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, जिसमें एक माइक्रोचिप, तीन हीटिंग ब्लॉक और एक स्टेपर मोटर ([63] से अनुकूलित) शामिल है।डी सेंट्रीफ्यूजेशन और सेटअप के साथ थर्मोकॉनवेक्शन पीसीआर का आरेख ([64] से अनुकूलित)।डीआईआरआरटी-क्यूपीसीआर, प्रत्यक्ष मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन
केशिकाओं और छोरों या पतली प्लेटों का उपयोग करके, संवहन पीसीआर बाहरी पंप की आवश्यकता के बिना प्राकृतिक मुक्त थर्मल संवहन द्वारा न्यूक्लिक एसिड को तेजी से बढ़ा सकता है।उदाहरण के लिए, एक चक्रीय ओलेफिन पॉलीमर माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म को एक गढ़े हुए घूर्णन ताप चरण पर विकसित किया गया था जो एक पीसीआर लूप माइक्रोचैनल [64] (चित्र 3डी) में सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ थर्मल साइकलिंग का उपयोग करता है।प्रतिक्रिया समाधान थर्मल संवहन द्वारा संचालित होता है, जो एक सूक्ष्म चैनल में एक कुंडलाकार संरचना के साथ लगातार उच्च और निम्न तापमान का आदान-प्रदान करता है।संपूर्ण प्रवर्धन प्रक्रिया को 70.5 pg/चैनल की पहचान सीमा के साथ 10 मिनट में पूरा किया जा सकता है।
जैसा कि अपेक्षित था, रैपिड पीसीआर पूरी तरह से एकीकृत नमूना-प्रतिक्रिया आणविक निदान और मल्टीप्लेक्स विश्लेषण प्रणालियों के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।रैपिड पीसीआर SARS-CoV-2 का पता लगाने में लगने वाले समय को काफी कम कर देता है, जो COVID-19 महामारी के प्रभावी नियंत्रण में योगदान देता है।
पीसीआर को एक जटिल थर्मल साइक्लर की आवश्यकता होती है जो पीओसीटी के लिए उपयुक्त नहीं है।हाल ही में, इज़ोटेर्मल प्रवर्धन तकनीकों को माइक्रोफ्लुइडिक्स पर लागू किया गया है, जिसमें LAMP, रीकॉम्बिनेज़ पोलीमरेज़ एम्प्लीफ़िकेशन (RPA), और न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमों पर आधारित प्रवर्धन [65,66,67,68] शामिल हैं, लेकिन इन्हीं तक सीमित नहीं हैं।इन तकनीकों के साथ, न्यूक्लिक एसिड को एक स्थिर तापमान पर प्रवर्धित किया जाता है, जिससे आणविक निदान के लिए कम लागत, अत्यधिक संवेदनशील पोर्टेबल POCT उपकरणों के निर्माण की सुविधा मिलती है।
उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित LAMP assays संक्रामक रोगों [42, 69, 70, 71] के कई पता लगाने की अनुमति देते हैं।एक केन्द्रापसारक माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली के संयोजन में, LAMP न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के स्वचालन को और अधिक सुविधाजनक बना सकता है [69, 72, 73, 74, 75]।स्पिन-एंड-रिएक्शन स्लिपचिप को LAMP [76] (चित्र 4a) का उपयोग करते हुए कई समानांतर बैक्टीरिया के दृश्य पता लगाने के लिए विकसित किया गया था।परख में अनुकूलित LAMP का उपयोग करते समय, प्रतिदीप्ति सिग्नल-टू-शोर अनुपात लगभग 5 गुना था, और पता लगाने की सीमा जीनोमिक डीएनए की 7.2 प्रतियों / μl तक पहुंच गई। इसके अलावा, बैसिलस सेरेस, एस्चेरिचिया कोलाई, साल्मोनेला एंटरिका, विब्रियो फ्लुवियलिस और विब्रियो पैराहामोलिटिकस सहित पांच सामान्य पाचन जीवाणु रोगजनकों के अस्तित्व की कल्पना <60 मिनट में विधि के आधार पर की गई थी। इसके अलावा, बैसिलस सेरेस, एस्चेरिचिया कोलाई, साल्मोनेला एंटरिका, विब्रियो फ्लुवियलिस और विब्रियो पैराहामोलिटिकस सहित पांच सामान्य पाचन जीवाणु रोगजनकों के अस्तित्व की कल्पना <60 मिनट में विधि के आधार पर की गई थी।इसके अलावा, बैसिलस सेरेस, एस्चेरिचिया कोलाई, साल्मोनेला एंटरिका, विब्रियो फ्लुवियलिस और विब्रियो पैराहामोलिटिकस सहित पाचन तंत्र के पांच सामान्य जीवाणु रोगजनकों की उपस्थिति को 60 मिनट से भी कम समय में इस पद्धति का उपयोग करके देखा गया था।<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。60 हिपइसके अलावा, बैसिलस सेरेस, एस्चेरिचिया कोलाई, साल्मोनेला एंटरिका, विब्रियो फ्लुवियस और विब्रियो पैराहामोलिटिकस सहित पांच सामान्य जीवाणु गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोगजनकों की उपस्थिति को 60 मिनट से भी कम समय में इस पद्धति का उपयोग करके देखा गया था।
माइक्रोफ्लुइडिक्स में एलएएमपी के फायदों में, दूसरों के बीच, तेजी से प्रतिक्रिया और लघु पहचान शामिल हैं।हालांकि, प्रतिक्रिया तापमान (लगभग 70 डिग्री सेल्सियस) के कारण, एलएएमपी के दौरान एरोसोल अनिवार्य रूप से उत्पन्न होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप उच्च झूठी सकारात्मक दर होती है।परख विशिष्टता, प्राइमर डिजाइन और तापमान नियंत्रण को भी LAMP के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है।इसके अलावा, एक चिप पर कई लक्ष्य पहचान को लागू करने वाले चिप डिजाइन बहुत महत्वपूर्ण हैं और उन्हें विकसित किया जाना चाहिए।इसके अलावा, LAMP एक चिप में एकीकृत बहुउद्देश्यीय पहचान के लिए उपयुक्त है, जिसका बहुत महत्व है, लेकिन अभी भी विकास के लिए बहुत जगह है।
LAMP की उच्च झूठी सकारात्मक दर को RPA के साथ आंशिक रूप से कम किया जा सकता है, क्योंकि अपेक्षाकृत कम प्रतिक्रिया तापमान (~37 °C) के परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत कम वाष्पीकरण की समस्या होती है [77]।आरपीए प्रणाली में, दो विपरीत प्राइमर एक पुनर्संयोजन के लिए बाध्य करके डीएनए संश्लेषण शुरू करते हैं और प्रवर्धन 10 मिनट [78,79,80,81] के भीतर पूरा किया जा सकता है।इसलिए, संपूर्ण RPA प्रक्रिया PCR या LAMP की तुलना में बहुत तेज है।हाल के वर्षों में, माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक को आरपीए [82,83,84] की गति और सटीकता में और सुधार करने के लिए दिखाया गया है।उदाहरण के लिए, लियू एट अल।[85] रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन RPA (RT-RPA) और एक यूनिवर्सल लेटरल फ्लो टेस्ट स्ट्रिप डिटेक्शन सिस्टम को एकीकृत करके SARS-CoV-2 की तीव्र और संवेदनशील पहचान के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक एकीकृत पार्श्व प्रवाह पोलीमरेज़ रीकॉम्बिनेज़ एम्प्लीफिकेशन परख विकसित की।एक एकल माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली में।चित्रा 4 बी)।पता लगाने की सीमा 1 प्रति/μl या 30 प्रतियां/नमूना है, और पता लगाने को लगभग 30 मिनट में पूरा किया जा सकता है।कोंग एट अल।एक पहनने योग्य माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण विकसित किया है।[86] आरपीए (चित्रा 4सी) का उपयोग करके एचआईवी -1 डीएनए का तेजी से और सीधे पता लगाने के लिए शरीर के तापमान और एक मोबाइल फोन-आधारित फ्लोरोसेंस डिटेक्शन सिस्टम का इस्तेमाल किया।पहनने योग्य आरपीए परख 24 मिनट के भीतर लक्ष्य अनुक्रम की 100 प्रतियों / एमएल का पता लगाता है, जो संसाधन-सीमित सेटिंग्स में एचआईवी-1-संक्रमित शिशुओं के तेजी से निदान के लिए काफी संभावनाएं प्रदर्शित करता है।
पॉइंट-ऑफ-केयर टेस्टिंग (POCT) में इज़ोटेर्मल एम्प्लीफिकेशन।स्पिन और प्रतिक्रिया स्लिपचिप का विकास और उत्पादन।प्लाज्मा वेल्डिंग के बाद, अंतिम चिप बनाने के लिए ऊपर और नीचे के चिप्स को नट्स के एक सेट के साथ इकट्ठा किया गया ([76] से अनुकूलित)।b COVID-19 का पता लगाने के लिए MI-IF-RPA प्रणाली की योजनाबद्ध ([85] से अनुकूलित)।c एचआईवी-1 डीएनए का तेजी से पता लगाने के लिए पहनने योग्य आरपीए परीक्षण की योजनाबद्ध ([86] से अनुकूलित)।एसई साल्मोनेला एंटरिका, वीएफ विब्रियो फ्लुवियस, वीपी विब्रियो पैराहामोलिटिकस, बीसी बैसिलस सेरेस, ईसी एस्चेरिचिया कोलाई, एफएएम कार्बोक्सीफ्लोरेसिन, मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस एचआईवी, आरपीए रीकॉम्बिनेज पोलीमरेज़ एम्प्लीफिकेशन, एलईडी लाइट एमिटिंग डायोड, एमआई-आईएफ-आरपीए फ्लो माइक्रोफ्लुइडिक्स इंटीग्रेटेड लेटरल लेटरल विस्तारण
माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित आरपीए तेजी से विकसित हो रहा है, हालांकि, चिप निर्माण और प्रतिक्रिया खपत की लागत बहुत अधिक है और इस तकनीक की उपलब्धता को बढ़ाने के लिए इसे कम किया जाना चाहिए।इसके अलावा, आरपीए की उच्च संवेदनशीलता गैर-विशिष्ट उत्पादों के प्रवर्धन को प्रभावित कर सकती है, विशेष रूप से संदूषण की उपस्थिति में।ये सीमाएं माइक्रोफ्लुइडिक प्रणालियों में आरपीए के अनुप्रयोग को प्रभावित कर सकती हैं और आगे अनुकूलन योग्य हो सकती हैं।पीओसीटी में आरपीए-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक रणनीतियों की व्यवहार्यता में सुधार के लिए विभिन्न लक्ष्यों के लिए अच्छी तरह से डिज़ाइन किए गए प्राइमर और जांच की भी आवश्यकता है।
Cas13 और Cas12a में न्यूक्लिक एसिड को बेतरतीब ढंग से साफ करने की क्षमता है और इस प्रकार इसे डिटेक्शन और डायग्नोस्टिक टूल के रूप में विकसित किया जा सकता है।Cas13 और Cas12a क्रमशः डीएनए या आरएनए को लक्षित करने के लिए बाध्य होने पर सक्रिय होते हैं।एक बार सक्रिय होने के बाद, प्रोटीन पास के अन्य न्यूक्लिक एसिड को साफ करना शुरू कर देता है, जिसके बाद रोगजनक-विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड को लक्षित करने वाले आरएनए बुझती फ्लोरोसेंट जांच को साफ कर सकते हैं और फ्लोरोसेंस जारी कर सकते हैं।इस सिद्धांत के आधार पर, केल्नर एट अल।[87] एक Cas13-आधारित विधि विकसित की [विशिष्ट उच्च-संवेदनशीलता एंजाइमेटिक रिपोर्टर अनलॉकिंग (शर्लक)], और ब्रॉटन एट अल।[88] Cas12a पर आधारित एक और दृष्टिकोण विकसित किया [CRISPR ट्रांस रिपोर्टर डीएनए एंडोन्यूक्लिज़ (DTECR) को लक्षित करता है]।
हाल के वर्षों में, CRISPR पर आधारित न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के विभिन्न तरीके सामने आए हैं [89, 90]।न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, प्रवर्धन और सीआरआईएसपीआर का पता लगाने सहित कई प्रक्रियाओं के कारण पारंपरिक सीआरआईएसपीआर आधारित विधियां अक्सर समय लेने वाली और श्रम गहन होती हैं।हवा में तरल पदार्थों के संपर्क में आने से झूठे सकारात्मक परिणामों की संभावना बढ़ सकती है।उपरोक्त को देखते हुए, सीआरआईएसपीआर-आधारित प्रणालियों को अनुकूलन की सख्त जरूरत है।
CRISPR-Cas12a और CRISPR-Cas13a डिटेक्शन एप्लिकेशन [91] के लिए एक न्यूमेटिकली नियंत्रित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म जो समानांतर में 24 विश्लेषण कर सकता है, विकसित किया गया है।सिस्टम एक फ्लोरोसेंस डिटेक्शन डिवाइस से लैस है जो न्यूक्लिक एसिड एम्प्लीफिकेशन को बायपास करता है और स्वचालित रूप से फीमेटोमोलर डीएनए और आरएनए नमूनों का पता लगाता है।चेन एट अल।[92] केन्द्रापसारक माइक्रोफ्लुइडिक्स (चित्र 5ए) में सीआरआईएसपीआर-कैस12ए प्रणाली के साथ एकीकृत पुनर्संयोजन प्रवर्धन।यह कार्य इन दो प्रक्रियाओं को एकीकृत करने की कठिनाई को दूर करता है क्योंकि Cas12a मैसेंजर डीएनए को पचा सकता है और प्रवर्धन प्रक्रिया को बाधित कर सकता है।इसके अलावा, चेन एट अल।[92] इसके अतिरिक्त प्रतिक्रिया अभिकर्मकों को पूरी प्रक्रिया को स्वचालित रूप से पूरा करने के लिए एक केन्द्रापसारक माइक्रोफ्लुइडिक नियंत्रण में पूर्व-संग्रहीत किया जाता है।एक अन्य काम में, सिल्वा एट अल।[93] ने बिना CRISPR/Cas12a प्रवर्धन और SARS-CoV-2 (चित्र 5बी) का पता लगाने के लिए एक स्मार्टफोन के बिना एक नैदानिक ​​पद्धति विकसित की।सेल फोन-आधारित एम्पलीफिकेशन-फ्री सिस्टम के रूप में जाना जाने वाला यह परख, एक सीआरआईएसपीआर/कैस-आश्रित एंजाइम शामिल है जो माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में कैटेलेज-जनरेटेड बबल सिग्नल के स्मार्टफोन विज़ुअलाइज़ेशन पर आधारित है।पूर्व-प्रवर्धन के बिना न्यूक्लिक एसिड की 50 प्रतियों / μl से कम की संवेदनशील पहचान, नमूना इंजेक्शन से सिग्नल रीडिंग तक की पूरी प्रक्रिया में केवल 71 मिनट लगते हैं।
CRISPR पर आधारित न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के तरीके।CRISPR पर आधारित एकीकृत आणविक निदान के लिए केन्द्रापसारक POCT ([92] से अनुकूलित)।b SARS-CoV-2 के स्मार्टफोन-आधारित विश्लेषण के लिए CASCADE परीक्षण का विकास ([93] से अनुकूलित)।आरएए रीकॉम्बिनेज एम्प्लीफिकेशन, पीएएम आसन्न प्रोटोस्पेसर मोटिफ, सीआरआईएसपीआर नियमित अंतराल पर छोटे पैलिंड्रोमिक दोहराव, सीआरआईएसपीआर / सीएएस-निर्भर एंजाइमों के साथ सेल फोन प्रवर्धन के बिना कैस्केड सिस्टम, 1-एथिल-3- [3-डाइमिथाइलैमिनोप्रोपाइल] कार्बोडायमाइड हाइड्रोक्लोराइड ईडीसी
न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन में अंतिम चरण के रूप में, सिग्नल डिटेक्शन सीधे नैदानिक ​​​​परिणामों को दर्शाता है और एक कुशल, संवेदनशील और सटीक पीओसीटी के विकास में एक महत्वपूर्ण कारक है।फ्लोरोसेंट, इलेक्ट्रोकेमिकल, वर्णमिति और चुंबकीय रणनीतियों जैसे विभिन्न तरीकों का उपयोग करके संकेतों को पढ़ा जा सकता है।इस खंड में, हम प्रत्येक दृष्टिकोण के औचित्य का वर्णन करते हैं और माइक्रोफ्लुइडिक्स में संक्रामक रोगों के आणविक निदान की तुलना करते हैं।
उत्कृष्ट संवेदनशीलता, कम लागत, संचालन में आसानी और बिंदु-देखभाल विश्लेषण [94, 95] के उनके उल्लेखनीय लाभों के कारण संक्रामक रोगों के पीओसीटी निदान के लिए प्रतिदीप्ति-आधारित रणनीतियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।ये रणनीतियाँ एक डिटेक्टेबल सिग्नल (प्रतिदीप्ति वृद्धि या शमन) बनाने के लिए फ्लोरोसेंट डाई और नैनोमैटिरियल्स जैसे लेबल वाले फ्लोरोफोर्स का उपयोग करती हैं।इस खोज से पता चलता है कि प्रतिदीप्ति-आधारित रणनीतियों को प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट लेबलिंग, सिग्नल-ऑन और सिग्नल-ऑफ फ्लोरोसेंट डिटेक्शन [96] में विभाजित किया जा सकता है।प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट लेबल का पता लगाने के लिए विशिष्ट लिगेंड को लेबल करने के लिए विशेष फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग किया जाता है जो एक विशिष्ट मात्रा में प्रतिदीप्ति उत्पन्न करते हैं जब चुनिंदा लक्ष्य के लिए बाध्य होते हैं।सिग्नल-आधारित फ्लोरेसेंस डिटेक्शन के लिए, फ्लोरोसेंट सिग्नल की गुणवत्ता सकारात्मक रूप से ब्याज की परिमाण से संबंधित है।लक्ष्य की अनुपस्थिति में प्रतिदीप्ति तीव्रता नगण्य है और पर्याप्त मात्रा में लक्ष्य मौजूद होने पर इसका पता लगाया जा सकता है।इसके विपरीत, "सिग्नल-ऑफ" प्रतिदीप्ति द्वारा पता लगाया गया प्रतिदीप्ति की तीव्रता लक्ष्य की मात्रा के व्युत्क्रमानुपाती होती है, शुरू में अधिकतम मूल्य तक पहुंचती है और धीरे-धीरे कम हो जाती है क्योंकि लक्ष्य बड़ा हो जाता है।उदाहरण के लिए, CRISPR-Cas13a लक्ष्य-निर्भर ट्रांस-क्लीवेज तंत्र का उपयोग करते हुए, तियान एट अल।[97] आरएनए का पता लगाने के लिए एक नई पहचान रणनीति विकसित की जो सीधे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को बायपास करती है (चित्र 6ए)।पूरक लक्ष्य आरएनए के लिए बाध्य होने पर, सीआरआईएसपीआर-कैस13-आरएनए कॉम्प्लेक्स को सक्रिय किया जा सकता है, गैर-विशिष्ट रिपोर्टर आरएनए द्वारा ट्रांसकोलेटरल क्लीवेज को ट्रिगर किया जा सकता है।फ्लोरोसेंटली लेबल वाले रिपोर्टर [फ्लोरोफोर (एफ)] को क्वेंचर (क्यू) द्वारा बुझाया जाता है और सक्रिय परिसर द्वारा क्लीव किए जाने पर फ्लोरोसिस होता है।
इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन का लाभ उच्च गति, आसान उत्पादन, कम लागत, ले जाने में आसान और स्वचालित नियंत्रण है।यह POCT अनुप्रयोगों के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक विधि है।ग्राफीन क्षेत्र-प्रभाव ट्रांजिस्टर पर आधारित गाओ एट अल।[98] बोरेलिया बर्गडोरफेरी बैक्टीरिया से लाइम रोग प्रतिजनों के मल्टीप्लेक्स डिटेक्शन के लिए 2 पीजी/एमएल (चित्र 6बी) की पहचान सीमा के साथ एक नैनोबायोसेंसर विकसित किया।
पोर्टेबिलिटी, कम लागत, तैयारी में आसानी और दृश्य पढ़ने के लाभों से लाभान्वित होकर, POCT अनुप्रयोगों में Colorimetric assays का उपयोग किया गया है।वर्णमिति का पता लगाने के लिए पेरोक्सीडेज या पेरोक्सीडेज-जैसे नैनोमटेरियल्स के ऑक्सीकरण, नैनोमटेरियल्स का एकत्रीकरण, और संकेतक रंगों के अलावा लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड की उपस्थिति के बारे में जानकारी को दृश्यमान रंग परिवर्तनों में परिवर्तित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है [99, 100, 101]।विशेष रूप से, वर्णमिति रणनीतियों के विकास में सोने के नैनोकणों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, और तेजी से और महत्वपूर्ण रंग परिवर्तनों को प्रेरित करने की उनकी क्षमता के कारण, संक्रामक रोगों के स्वस्थानी निदान के लिए POCT वर्णमिति प्लेटफार्मों के विकास में रुचि बढ़ रही है [102]।एक एकीकृत केन्द्रापसारक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस [103] के साथ, दूषित दूध के नमूनों में खाद्य जनित रोगजनकों को 10 जीवाणु कोशिकाओं के स्तर पर स्वचालित रूप से पता लगाया जा सकता है, और परिणाम 65 मिनट (छवि 6c) के भीतर दृष्टिगत रूप से पढ़े जा सकते हैं।
चुंबकीय संवेदन तकनीक चुंबकीय सामग्री का उपयोग करके विश्लेषणों का सटीक रूप से पता लगा सकती है, और हाल के दशकों में POCT अनुप्रयोगों में महत्वपूर्ण रुचि रही है।चुंबकीय संवेदन तकनीकों के कुछ अनूठे फायदे हैं जैसे महंगे ऑप्टिकल घटकों के बजाय कम लागत वाली चुंबकीय सामग्री।हालांकि, चुंबकीय क्षेत्र के उपयोग से पता लगाने की दक्षता में सुधार होता है और नमूना तैयार करने में लगने वाला समय कम हो जाता है [104]।इसके अलावा, चुंबकीय जांच के परिणाम जैविक नमूनों [105] के नगण्य चुंबकीय पृष्ठभूमि संकेत के कारण उच्च विशिष्टता, संवेदनशीलता और उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदर्शित करते हैं।शर्मा एट अल।एक पोर्टेबल माइक्रोचिप प्लेटफॉर्म में एक चुंबकीय सुरंग जंक्शन आधारित बायोसेंसर को एकीकृत किया।[106] रोगजनकों के मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए (चित्र 6डी)।बायोसेंसर संवेदनशील रूप से रोगजनकों से पृथक सबनैनोमोलर न्यूक्लिक एसिड का पता लगाते हैं।
विशिष्ट संकेत पहचान विधि।Cas13a के हाइपरलोकलाइज़्ड डिटेक्शन की अवधारणा ([97] से अनुकूलित)।बी ग्राफीन नैनोबायोसेंसर FET लाइम ग्रोस scFv के साथ संयोजन में ([98] से अनुकूलित)।सी सेंट्रीफ्यूगल माइक्रोफ्लुइडिक चिप में खाद्यजनित रोगजनकों के मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए वर्णमिति संकेत: लक्ष्य रोगजनकों के साथ नंबर 1 और नंबर 3 नमूने, और लक्ष्य रोगजनकों के बिना नंबर 2, नंबर 4 और नंबर 5 नमूने ([103] से अनुकूलित) .डी बायोसेंसर एक चुंबकीय सुरंग जंक्शन पर आधारित है, जिसमें एक प्लेटफॉर्म, एक अंतर्निर्मित अवरोधक एम्पलीफायर, एक नियंत्रण इकाई, और सिग्नल उत्पादन/अधिग्रहण के लिए एक बिजली आपूर्ति शामिल है ([106] से अनुकूलित)।जीएफईटी ग्राफीन एफईटी, एस्चेरिचिया कोलाई, एस्चेरिचिया कोलाई, साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम, विब्रियो पैराहामोलिटिकस, विब्रियो पैराहामोलिटिकस, लिस्टेरिया मोनोसाइटोजेन्स, पीसी पीसी, पीडीएमएस डाइमेथिकोन, पीएमएमए पॉलीमेथाइल मेथैक्रिलेट
उपरोक्त पता लगाने के तरीकों की उत्कृष्ट विशेषताओं के बावजूद, उनके पास अभी भी नुकसान हैं।इन विधियों की तुलना (तालिका 1) की जाती है, जिसमें विवरण के साथ कुछ एप्लिकेशन (पेशेवरों और विपक्ष) शामिल हैं।
माइक्रोफ्लुइडिक्स, माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम, नैनोटेक्नोलॉजी और सामग्री विज्ञान के विकास के साथ, संक्रामक रोगों का पता लगाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स का उपयोग लगातार बढ़ रहा है [55,96,107,108]।लघु उपकरणों और तरल पदार्थों का सटीक हेरफेर नैदानिक ​​​​सटीकता और लागत-प्रभावशीलता में योगदान देता है।इसलिए, आगे के विकास के लिए, चिप्स को अनुकूलित और उन्नत करने के प्रयास किए गए हैं, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स विभिन्न संरचनाओं और कार्यों के साथ हैं।यहां हम संक्षेप में कई सामान्य प्रकार के माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों का परिचय देते हैं और उनकी विशेषताओं (पेशेवरों और विपक्षों) की तुलना करते हैं।इसके अलावा, नीचे सूचीबद्ध अधिकांश उदाहरण मुख्य रूप से SARS-CoV-2 का मुकाबला करने पर केंद्रित हैं।
एलओसीसी सबसे आम लघुकृत जटिल विश्लेषणात्मक प्रणालियां हैं और उनके संचालन नमूना इंजेक्शन और तैयारी, प्रवाह नियंत्रण और तरल पहचान [109, 110] से अत्यधिक लघु, एकीकृत, स्वचालित और समानांतर हैं।तरल पदार्थों को सावधानीपूर्वक डिज़ाइन की गई ज्यामिति और दबाव प्रवणता, केशिका क्रिया, इलेक्ट्रोडायनामिक्स, चुंबकीय क्षेत्र और ध्वनिक तरंगों जैसे कई भौतिक प्रभावों की बातचीत के माध्यम से हेरफेर किया जाता है [111]।एलओसीसी तेजी से विश्लेषण गति, छोटे नमूना आकार, कम बिजली की खपत, और उच्च प्रबंधन और संचालन दक्षता के साथ उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और एकाधिक पहचान में उत्कृष्ट लाभ दिखाता है;हालाँकि, LOCC डिवाइस बहुत नाजुक होते हैं, और निर्माण, पैकेजिंग और इंटरफेसिंग होते हैं।हालांकि, बहुसंकेतन और पुन: उपयोग में भारी कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है [96]।अन्य प्लेटफार्मों की तुलना में, एलओसीसी के पास अधिकतम अनुप्रयोग विविधता और सर्वोत्तम प्रौद्योगिकी संगतता के मामले में अद्वितीय फायदे हैं, लेकिन इसके नुकसान भी स्पष्ट हैं, अर्थात् उच्च जटिलता और खराब दोहराव।बाहरी पंपों पर निर्भरता, जो अक्सर भारी और महंगे होते हैं, POCT में उनके उपयोग को और सीमित कर देते हैं।
COVID-19 के प्रकोप के दौरान, LOCC ने बहुत ध्यान आकर्षित किया।इसी समय, कई नए चिप्स हैं जो कई तकनीकों को जोड़ते हैं।उदाहरण के लिए, स्मार्टफोन अब व्यापक रूप से पोर्टेबल एनालिटिक्स डिवाइस के रूप में उपयोग किए जाते हैं और इनमें LOCC एकीकरण की काफी संभावनाएं हैं।सन एट अल।[21] एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप का निर्माण किया, जो LAMP का उपयोग करके SARS-CoV-2 सहित पांच रोगजनकों के विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमों को बहुसंकेतन करने की अनुमति देता है और प्रतिक्रिया समाप्त होने के 1 घंटे के भीतर स्मार्टफोन का उपयोग करके उनका विश्लेषण करता है।एक अन्य उदाहरण के रूप में, सुंदाह एट अल।[112] ने स्मार्टफोन का उपयोग करके SARS-CoV-2 RNA लक्ष्यों का प्रत्यक्ष और संवेदनशील पता लगाने के लिए एक आणविक स्विच [आणविक संक्रमण राज्य स्विच (CATCH) द्वारा उत्प्रेरक प्रवर्धन] बनाया। CATCH पोर्टेबल LOCC के साथ संगत है और बेहतर प्रदर्शन प्राप्त करता है (लगभग 8 RNA प्रतियां/μl; <1 घंटे कमरे के तापमान पर) [112]। CATCH पोर्टेबल LOCC के साथ संगत है और बेहतर प्रदर्शन प्राप्त करता है (लगभग 8 RNA प्रतियां/μl; <1 घंटे कमरे के तापमान पर) [112]। [कैच совместим с ортативным LOCC और обеспечивает ревосходную роизводительность (примерно 8 копий; CATCH पोर्टेबल LOCC के साथ संगत है और उत्कृष्ट थ्रूपुट प्रदान करता है (लगभग 8 RNA प्रतियां/μl; <1 घंटे कमरे के तापमान पर) [112]। कैच LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 आरएनए 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 कैच LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 आरएनए 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 [कैच совместим с ортативными LOCC और обладает ревосходной роизводительностью (примерно 8 копин 1 / мкл; CATCH पोर्टेबल LOCCs के साथ संगत है और इसमें उत्कृष्ट प्रदर्शन है (लगभग 8 RNA प्रतियां/μl; <कमरे के तापमान पर 1 घंटा) [112]।इसके अलावा, आणविक निदान के लिए LOCC डिवाइस कुछ ड्राइविंग बलों जैसे वैक्यूम, खिंचाव और बिजली के क्षेत्रों का भी उपयोग करते हैं।कांग एट अल।[113] एक वैक्यूम प्लास्मोनिक लिक्विड पीसीआर चिप का उपयोग करके क्षेत्र में COVID-19 के तेजी से और मात्रात्मक निदान के लिए एक वास्तविक समय, अल्ट्रा-फास्ट नैनोप्लाज्मा-ऑन-ए-चिप पीसीआर का प्रदर्शन किया।ली एट अल।[114] बाद में एक खिंचाव-चालित माइक्रोफ्लुइडिक चिप विकसित की जिसने COVID-19 के निदान को सक्षम किया।एक नमूना गुणात्मक रूप से सकारात्मक या नकारात्मक है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए प्लेटफ़ॉर्म RT-LAMP प्रवर्धन प्रणाली का उपयोग करता है।इसके बाद, रामचंद्रन एट अल।[115] आइसोटाकोफोरेसिस (आईटीपी) का उपयोग करते हुए उपयुक्त विद्युत क्षेत्र प्रवणता हासिल की, माइक्रोफ्लुइडिक्स में लागू एक चयनात्मक आयन फ़ोकसिंग तकनीक।आईटीपी के साथ, कच्चे नासोफेरींजल स्वैब नमूनों से आरएनए को स्वचालित रूप से शुद्ध किया जा सकता है।फिर रामचंद्रन एट अल।[115] इस आईटीपी शुद्धिकरण को आईटीपी-संवर्धित LAMP और CRISPR assays के साथ मिलाने से लगभग 35 मिनट में मानव नासॉफिरिन्जियल स्वैब और नैदानिक ​​नमूनों में SARS-CoV-2 का पता चला।इसके अलावा, नए विचार लगातार सामने आ रहे हैं।जाधव एट अल.[116] सतह-संवर्धित रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी पर आधारित एक नैदानिक ​​योजना का प्रस्ताव किया जिसमें एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के साथ संयोजन में या तो लंबवत उन्मुख सोना / चांदी-लेपित कार्बन नैनोट्यूब या डिस्पोजेबल इलेक्ट्रोसपुन माइक्रो / नैनोट्यूब शामिल हैं।मेम्ब्रेन-फंक्शनल बिल्ट-इन फिल्टर माइक्रोचैनल डिस्पोजेबल हैं।यह उपकरण शरीर के विभिन्न तरल पदार्थों / एक्सयूडीशन जैसे लार, नासोफरीनक्स और आँसू से वायरस को सोख लेता है।इस प्रकार, वायरस टिटर प्रचुर मात्रा में है और रमन हस्ताक्षर द्वारा वायरस को सटीक रूप से पहचाना जा सकता है।
लोड एक केन्द्रापसारक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म है जिसमें सभी प्रक्रियाओं को एक आवृत्ति प्रोटोकॉल द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो एक माइक्रोस्ट्रक्चर सब्सट्रेट को घुमाता है [110]।लोड डिवाइस को एक महत्वपूर्ण प्रेरक शक्ति के रूप में केन्द्रापसारक बल का उपयोग करके विशेषता है।तरल भी केशिका, यूलर और कोरिओलिस बलों के अधीन हैं।एक अपकेंद्रित्र उपकरण का उपयोग करके, अतिरिक्त बाहरी टयूबिंग, पंप, एक्चुएटर और सक्रिय वाल्व की आवश्यकता को समाप्त करते हुए, एक रेडियल आवक से बाहरी स्थिति तक निरंतर तरल संचालन में विश्लेषण किया जाता है।संक्षेप में, एकल नियंत्रण विधि ऑपरेशन को सरल बनाती है।लोड केंद्र से समान दूरी पर एक ही माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में तरल पर अभिनय करने वाले बल समान होते हैं, जिससे चैनल संरचना को दोहराना संभव हो जाता है।इस प्रकार, LOAD उपकरण पारंपरिक LOCC उपकरणों की तुलना में डिजाइन और निर्माण के लिए सरल और अधिक किफायती है, जबकि प्रतिक्रियाएं काफी हद तक स्वतंत्र और समानांतर हैं;हालांकि, केन्द्रापसारक उपकरणों की उच्च यांत्रिक शक्ति के कारण, उपलब्ध चिप सामग्री सीमित है और छोटी मात्रा मुश्किल है।कार की ओर।साथ ही, अधिकांश लोड डिवाइस केवल एकल उपयोग के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, जो बड़े पैमाने पर पता लगाने के लिए महंगा है [96, 117, 118, 119]।
हाल के दशकों में, लोड, जिसे सबसे होनहार माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में से एक माना जाता है, ने शोधकर्ताओं और निर्माताओं से काफी ध्यान आकर्षित किया है।इस प्रकार, LOAD ने व्यापक स्वीकृति प्राप्त की है और इसका उपयोग संक्रामक रोगजनकों [120, 121, 122, 123, 124] के आणविक निदान के लिए किया गया है, विशेष रूप से COVID-19 के प्रकोप के दौरान।उदाहरण के लिए, 2020 के अंत में, जी एट अल।[60] गले के स्वाब नमूनों में SARS-CoV-2 और इन्फ्लूएंजा A और B संक्रमणों की तीव्र और स्वचालित समानांतर पहचान के लिए एक प्रत्यक्ष RT-qPCR परख का प्रदर्शन किया।फिर जिओंग एट अल।[74] ने 40 मिनट के भीतर सार्स-सीओवी-2 सहित सात मानव श्वसन कोरोनविर्यूज़ का तेजी से, सटीक और एक साथ पता लगाने के लिए एक लैंप-एकीकृत डिस्कोइड माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म प्रस्तुत किया।2021 की शुरुआत में, डी ओलिवेरा एट अल।[73] COVID-19 के RT-LAMP आणविक निदान के लिए, एक पॉलीस्टाइन टोनर सेंट्रीफ्यूगल माइक्रोफ्लुइडिक चिप का प्रदर्शन किया, जो मैन्युअल रूप से एक उंगलियों के रोटेटर के साथ संचालित होता है।इसके बाद, डिग्नन एट अल।[39] सीधे बुक्कल स्वैब सेक्शन से SARS-CoV-2 RNA के शुद्धिकरण के लिए एक स्वचालित पोर्टेबल सेंट्रीफ्यूज माइक्रोदेविस प्रस्तुत किया।मेदवेद एट अल।[53] एक इनलाइन SARS-CoV-2 एरोसोल सैंपलिंग सिस्टम का प्रस्ताव रखा जिसमें 10 प्रतियों/μL की पहचान सीमा और 15 मिनट की न्यूनतम चक्र सीमा के साथ एक छोटी मात्रा में घूमने वाली माइक्रोफ्लुइडिक फ्लोरोसेंट चिप हो।सुआरेज़ एट अल।[75] हाल ही में LAMP का उपयोग करते हुए गर्मी-निष्क्रिय नासॉफिरिन्जियल स्वैब नमूनों में SARS-CoV-2 RNA के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए एक एकीकृत मॉड्यूलर सेंट्रीफ्यूगल माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के विकास की सूचना दी।ये उदाहरण COVID-19 के आणविक निदान में LOAD के महान लाभ और वादे को प्रदर्शित करते हैं।
1945 में मुलर और क्लेग [125] ने पहली बार फिल्टर पेपर और पैराफिन का उपयोग करके कागज पर माइक्रोफ्लुइडिक चैनल प्रस्तुत किए।2007 में, व्हाइटसाइड्स समूह [126] ने प्रोटीन और ग्लूकोज परीक्षण के लिए पहला कार्यात्मक पेपर प्लेटफॉर्म बनाया।कागज माइक्रोफ्लुइडिक्स के लिए एक आदर्श सब्सट्रेट बन गया है।कागज में हाइड्रोफिलिसिटी और झरझरा संरचना, उत्कृष्ट जैव-अनुकूलता, हल्के वजन, लचीलापन, फोल्डेबिलिटी, कम लागत, उपयोग में आसानी और सुविधा जैसे अंतर्निहित गुण हैं।शास्त्रीय µPADs में पेपर सबस्ट्रेट्स पर निर्मित हाइड्रोफिलिक/हाइड्रोफोबिक संरचनाएं होती हैं।त्रि-आयामी संरचना के आधार पर, μPAD को दो-आयामी (2D) और त्रि-आयामी (3D) μPAD में विभाजित किया जा सकता है।माइक्रोफ्लुइडिक चैनल बनाने के लिए हाइड्रोफोबिक सीमाओं का निर्माण करके 2D µPAD का उत्पादन किया जाता है, जबकि 3D µPAD आमतौर पर 2D माइक्रोफ्लुइडिक पेपर की परतों के ढेर से बनाए जाते हैं, कभी-कभी पेपर फोल्डिंग, स्लिप तकनीक, ओपन चैनल और 3D प्रिंटिंग [96] द्वारा।μPAD पर जलीय या जैविक तरल पदार्थ मुख्य रूप से बाहरी शक्ति स्रोत के बिना केशिका बल द्वारा नियंत्रित होते हैं, अभिकर्मकों के पूर्व-भंडारण, नमूना हैंडलिंग और मल्टीप्लेक्स का पता लगाने की सुविधा प्रदान करते हैं।हालांकि, सटीक प्रवाह नियंत्रण और मल्टीप्लेक्स डिटेक्शन अपर्याप्त पहचान गति, संवेदनशीलता और पुन: प्रयोज्य [96, 127, 128, 129, 130] से बाधित हैं।
एक असामान्य माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के रूप में, μPAD को व्यापक रूप से बढ़ावा दिया गया है और संक्रामक रोगों जैसे HCV, HIV और SARS-CoV-2 [131, 132] के आणविक निदान के लिए विकसित किया गया है।एचसीवी, टेंगम एट अल के चयनात्मक और संवेदनशील पता लगाने के लिए।[133] पायरोलिडिनिल पेप्टाइड पर आधारित अत्यधिक विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग करके फ्लोरोसेंट पेपर पर आधारित एक उपन्यास बायोसेंसर विकसित किया।न्यूक्लिक एसिड को अमीनो समूहों और एल्डिहाइड समूहों के बीच रिडक्टिव एल्केलाइज़ेशन द्वारा आंशिक रूप से ऑक्सीकृत सेलूलोज़ पेपर पर सहसंयोजक रूप से स्थिर किया जाता है, और पता लगाना प्रतिदीप्ति पर आधारित होता है।इन संकेतों को एक विशेष रूप से निर्मित गैजेट द्वारा एक पोर्टेबल फ्लोरोसेंट कैमरा के साथ एक सेल फोन कैमरे के संयोजन में पढ़ा जा सकता है।इसके बाद, लू एट अल।[134] डीएनए रेडॉक्स संकेतक के रूप में मिथाइलीन ब्लू का उपयोग करके डीएनए संकरण द्वारा एचआईवी लक्ष्य का पता लगाने के लिए निकल/गोल्ड नैनोपार्टिकल्स/कार्बन नैनोट्यूब/पॉलीविनाइल अल्कोहल ऑर्गेनोमेटेलिक फ्रेमवर्क कंपोजिट पर आधारित एक पेपर-आधारित लचीला इलेक्ट्रोड तैयार किया गया।हाल ही में, चौधरी एट अल।[135] ने COVID-19 एनालिसिस डिटेक्शन के लिए LAMP और पोर्टेबल इमेजिंग तकनीक के संयोजन में कच्चे रोगी की लार का उपयोग करके पॉइंट-ऑफ-केयर µPAD परीक्षण के लिए एक काल्पनिक प्लेटफ़ॉर्म डिज़ाइन प्रस्तुत किया।
पार्श्व प्रवाह परीक्षण केशिका बलों द्वारा तरल पदार्थ का मार्गदर्शन करते हैं और झरझरा या सूक्ष्म संरचित सब्सट्रेट की अस्थिरता और विशेषताओं द्वारा द्रव आंदोलन को नियंत्रित करते हैं।पार्श्व प्रवाह उपकरणों में नमूना, संयुग्म, इनक्यूबेटर और पहचान, और शोषक पैड शामिल हैं।एलएफए में न्यूक्लिक एसिड अणु विशिष्ट बाइंडरों को पहचानते हैं जो बाध्यकारी साइट पर पूर्व-संग्रहीत होते हैं और परिसरों के रूप में बंधे होते हैं।जैसे ही तरल ऊष्मायन और पहचान प्लेटों से गुजरता है, परिसरों को परीक्षण और नियंत्रण रेखाओं पर स्थित कैप्चर अणुओं द्वारा कब्जा कर लिया जाता है, ऐसे परिणाम दिखाते हैं जिन्हें सीधे नग्न आंखों को पढ़ा जा सकता है।आमतौर पर, LFA को 2-15 मिनट में पूरा किया जा सकता है, जो पारंपरिक खोज की तुलना में तेज़ है।विशेष तंत्र के कारण, एलएफए को कुछ संचालन की आवश्यकता होती है और अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, जो इसे बहुत उपयोगकर्ता के अनुकूल बनाती है।इसका निर्माण और लघुकरण करना आसान है, और कागज आधारित सबस्ट्रेट्स की लागत कम है।हालांकि, इसका उपयोग केवल गुणात्मक विश्लेषण के लिए किया जाता है, और मात्रात्मक पता लगाना बहुत मुश्किल है, और बहुसंकेतन क्षमता और थ्रूपुट बहुत सीमित हैं, और एक समय में केवल एक पर्याप्त न्यूक्लिक एसिड का पता लगाया जा सकता है [96,110,127]।
हालांकि एलएफए के अधिकांश अनुप्रयोग इम्युनोसे पर केंद्रित हैं, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में आणविक निदान के लिए एलएफए का उपयोग भी प्रभावी और लोकप्रिय है [136]।हेपेटाइटिस बी वायरस, एचआईवी और SARS-CoV-2 LFA Gong et al के मामले में।[137] एक अप-रूपांतरण नैनोपार्टिकल एलएफए प्लेटफॉर्म का प्रस्ताव रखा और एचबीवी न्यूक्लिक एसिड जैसे कई लक्ष्यों की संवेदनशील और मात्रात्मक पहचान के माध्यम से इस लघु और पोर्टेबल प्लेटफॉर्म की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन किया।इसके अलावा, फू एट अल।[138] कम सांद्रता पर एचआईवी-1 डीएनए के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सतह-संवर्धित रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी पर आधारित एक उपन्यास एलएफए का प्रदर्शन किया।SARS-CoV-2, लियू एट अल का तेजी से और संवेदनशील पता लगाने के लिए।[85] आरटी-आरपीए और एक सार्वभौमिक पार्श्व प्रवाह पहचान प्रणाली को एक एकल माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली में मिलाकर एक माइक्रोफ्लुइडिक-एकीकृत आरपीए पार्श्व प्रवाह विश्लेषण विकसित किया।
विभिन्न माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों का अनुप्रयोग विशिष्ट अध्ययनों के आधार पर भिन्न होता है, जो प्लेटफार्मों की क्षमताओं और लाभों का पूरा लाभ उठाते हैं।किफायती वाल्व, पंप और नलिकाओं के साथ, एलओसीसी विकास के लिए सबसे बड़ी जगह के साथ अनुप्रयोग विविधता और अंतःक्रियाशीलता के लिए सबसे व्यापक मंच है।इसलिए, हम आशा और अनुशंसा करते हैं कि पहले प्रयास के रूप में एलओसीसी में नवीनतम अध्ययन किए जाएं और शर्तों को अनुकूलित किया जाए।इसके अलावा, सिस्टम में अधिक कुशल और सटीक तरीकों की खोज और उपयोग किए जाने की उम्मीद है।LOAD मौजूदा LOCC उपकरणों से तरल पदार्थों के सटीक नियंत्रण में उत्कृष्टता प्राप्त करता है और बाहरी ड्राइव की आवश्यकता के बिना केन्द्रापसारक बल द्वारा एकल ड्राइव में अद्वितीय लाभ प्रदर्शित करता है, जबकि समानांतर प्रतिक्रियाएं अलग और सिंक्रनाइज़ हो सकती हैं।इस प्रकार, भविष्य में, लोड कम मैनुअल संचालन और अधिक परिपक्व और स्वचालित प्रौद्योगिकियों के साथ मुख्य माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म बन जाएगा।µPAD प्लेटफॉर्म कम लागत, एकल उपयोग निदान के लिए LOCC और कागज आधारित सामग्री के लाभों को जोड़ता है।इसलिए, भविष्य के विकास को सुविधाजनक और अच्छी तरह से स्थापित प्रौद्योगिकियों पर ध्यान देना चाहिए।इसके अलावा, एलएफए नग्न आंखों का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, नमूना खपत को कम करने और पता लगाने में तेजी लाने का वादा करता है।एक विस्तृत प्लेटफ़ॉर्म तुलना तालिका 2 में दिखाई गई है।
डिजिटल विश्लेषण नमूने को कई माइक्रोरिएक्टरों में विभाजित करते हैं, जिनमें से प्रत्येक में लक्ष्य अणुओं की असतत संख्या होती है [139, 140]।डिजिटल परख एक निरंतर चरण के बजाय माइक्रोन पैमाने के डिब्बों में एक साथ और व्यक्तिगत रूप से हजारों समानांतर जैव रासायनिक प्रयोगों का प्रदर्शन करके पूर्ण मात्रा का प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं।पारंपरिक माइक्रोफ्लुइडिक्स की तुलना में, कम्पार्टमेंट प्रतिक्रियाएं नमूना मात्रा को कम कर सकती हैं, प्रतिक्रिया दक्षता में वृद्धि कर सकती हैं, और चैनलों, पंपों, वाल्वों और कॉम्पैक्ट डिजाइनों की आवश्यकता के बिना अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों के साथ आसानी से एकीकृत हो सकती हैं [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147]।निम्नलिखित दो विधियों का उपयोग डिजिटल एसेज़ में समाधानों के एकसमान और सटीक पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए किया जाता है, जिसमें अभिकर्मकों और नमूनों जैसे कि सेल, न्यूक्लिक एसिड, और अन्य कण या अणु शामिल हैं: (1) तरल इंटरफ़ेस अस्थिरता का शोषण करने वाले ड्रॉप इमल्शन;(2) सरणी विभाजन उपकरण के ज्यामितीय अवरोधों द्वारा किया जाता है।पहली विधि में, माइक्रोचैनल में अभिकर्मकों और नमूनों वाली बूंदों को सह-वर्तमान, क्रॉसफ्लो, फ्लो फ़ोकसिंग, स्टेज्ड इमल्सीफिकेशन, माइक्रोचैनल इमल्सीफिकेशन, और झिल्ली को चिपचिपा कतरनी बलों के माध्यम से और चैनल परिवर्तन के साथ पायसीकरण जैसे निष्क्रिय तरीकों से बनाया जा सकता है।स्थानीयकरण [143, 145, 146, 148, 149] या सक्रिय विधियों का उपयोग [150, 151], जो विद्युत, चुंबकीय, थर्मल और यांत्रिक नियंत्रण के माध्यम से अतिरिक्त ऊर्जा का परिचय देते हैं।बाद के दृष्टिकोण में, माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में सबसे अच्छा द्रव मात्रा एकरूपता एक ही आकार के स्थानिक संरचनाओं, जैसे कि माइक्रोपिट्स और सतह सरणियों [152,153,154] को रखकर साझा किया जाता है।विशेष रूप से, बूंदें प्रमुख प्रवाह खंड हैं जिन्हें डिजिटल माइक्रोफ्लुइडिक्स (डीएमएफ) के आधार पर इलेक्ट्रोड सरणियों पर भी उत्पन्न और हेरफेर किया जा सकता है।डाइलेक्ट्रिक्स का इलेक्ट्रोवेटिंग सबसे अच्छे अध्ययन किए गए डीएमएफ सिद्धांतों में से एक है, क्योंकि डाइलेक्ट्रिक्स की इलेक्ट्रोवेटिंग अलग-अलग बूंदों के सटीक हेरफेर की अनुमति देती है, विभिन्न पक्षों से गुजरने वाले तरल और असममित विद्युत संकेतों के आकार को नियंत्रित करती है [141, 144]।डीएमएफ में बूंदों के साथ मुख्य संचालन में छँटाई, विभाजन और विलय [151, 155, 156] शामिल है, जिसे विश्लेषण के विभिन्न क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से आणविक पहचान [157, 158, 159] में।
डिजिटल न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण और तरल बायोप्सी के समानांतर पारंपरिक पीसीआर और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) के बाद तीसरी पीढ़ी की आणविक निदान तकनीक है।पिछले दो दशकों में, संक्रामक रोगजनकों के आणविक निदान के क्षेत्र में डिजिटल न्यूक्लिक एसिड तेजी से विकसित हुए हैं [160, 161, 162]।डिजिटल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की पूर्ण मात्रा का ठहराव नमूनों और अभिकर्मकों को अलग-अलग डिब्बों में पैक करने से शुरू होता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्रत्येक लक्ष्य अनुक्रम में प्रत्येक व्यक्तिगत डिब्बे में प्रवेश करने की समान संभावना है।सैद्धांतिक रूप से, प्रत्येक अनुभाग को कई लक्ष्य अनुक्रम दिए जा सकते हैं, या एक स्वतंत्र माइक्रोरिएक्शन सिस्टम नहीं हो सकता है।ऊपर वर्णित विभिन्न संवेदन तंत्रों के माध्यम से, एक निश्चित सीमा से ऊपर संकेत उत्पन्न करने वाले माइक्रोबियल लक्ष्य अनुक्रम वाले डिब्बों को नग्न आंखों या मशीन द्वारा देखा जा सकता है और उन्हें सकारात्मक के रूप में लेबल किया जाता है, जबकि अन्य डिब्बों जो थ्रेशोल्ड के नीचे संकेत उत्पन्न करते हैं उन्हें सकारात्मक के रूप में लेबल किया जाता है। .नकारात्मक वाले, जो प्रत्येक खंड के लिए एक बूलियन संकेत बनाते हैं।इस प्रकार, बनाए गए डिब्बों की संख्या और प्रतिक्रिया के बाद सकारात्मक परिणामों की दर की गणना करके, परीक्षण नमूनों की मूल प्रतियों को मानक वक्र की आवश्यकता के बिना पॉइसन वितरण सूत्र का उपयोग करके मिलान किया जा सकता है, जो नियमित मात्रात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक है जैसे कि क्यूपीसीआर के रूप में।[163] पारंपरिक आणविक निदान विधियों की तुलना में, डिजिटल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में उच्च स्तर का स्वचालन, उच्च विश्लेषण गति और संवेदनशीलता, कम अभिकर्मक, कम संदूषण और सरल डिजाइन और निर्माण होता है।इन कारणों से, आणविक निदान, प्रवर्धन और सिग्नल रीडआउट तकनीकों के संयोजन के लिए डिजिटल परख, विशेष रूप से ड्रॉप-आधारित विधियों का उपयोग, SARS-CoV-2 के महत्वपूर्ण प्रकोप के दौरान अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है।उदाहरण के लिए, यिन एट अल।[164] एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप में SARS-CoV-2 में ORF1ab, N, और RNase P जीन का पता लगाने के लिए डिजिटल और फास्ट पीसीआर विधियों को संयुक्त किया।विशेष रूप से, सिस्टम 115 सेकंड के भीतर एक सकारात्मक संकेत की पहचान करने में सक्षम था, जो पारंपरिक पीसीआर की तुलना में तेज है, जो पॉइंट-ऑफ-केयर डिटेक्शन (चित्रा 7ए) में इसकी प्रभावशीलता को दर्शाता है।डोंग एट अल।[165], बोना एट अल।[157], चेन एट अल।[166] और अल्टेरी एट अल।[167] प्रभावशाली परिणामों के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली में SARS-CoV-2 का पता लगाने के लिए ड्रॉपलेट डिजिटल PCR (ddPCR) भी लागू किया।पता लगाने की दर में और सुधार करने के लिए, शेन एट अल।[168] इमेज स्टिचिंग तकनीकों के उपयोग के बिना कम से कम 15 सेकेंड में डीडीपीसीआर-आधारित चिप इमेजिंग हासिल की, प्रयोगशाला से आवेदन तक डीडीपीसीआर प्रौद्योगिकी प्रक्रिया को तेज किया।न केवल पीसीआर जैसे थर्मल प्रवर्धन विधियों को लागू किया जाता है, बल्कि प्रतिक्रिया की स्थिति और तेजी से प्रतिक्रिया को सरल बनाने के लिए इज़ोटेर्मल प्रवर्धन विधियों का भी उपयोग किया जाता है।लू एट अल।[71] ड्रॉपलेट विश्लेषण के लिए स्लिपचिप विकसित किया, जो एक चरण में उच्च घनत्व पर विभिन्न आकारों की बूंदों को उत्पन्न करने में सक्षम है और डिजिटल LAMP (चित्र 7b) का उपयोग करके SARS-CoV-2 न्यूक्लिक एसिड की मात्रा निर्धारित करता है।तेजी से विकसित हो रही तकनीक के रूप में, सीआरआईएसपीआर अतिरिक्त न्यूक्लिक एसिड दागों की आवश्यकता के बिना सुविधाजनक वर्णमिति इमेजिंग के माध्यम से डिजिटल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।एकरमैन एट अल।न्यूक्लिक एसिड के मल्टीप्लेक्स मूल्यांकन के लिए एक कॉम्बीनेटरियल मैट्रिक्स रिएक्शन विकसित किया।[158] एक माइक्रोवेल परख (चित्रा 7सी) में सीआरआईएसपीआर-कैस13-आधारित न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन अभिकर्मकों वाली बूंदों में एसएआरएस-सीओवी-2 सहित 169 मानव-संबंधित वायरस का पता चला।इसके अलावा, इज़ोटेर्मल एम्प्लीफिकेशन और सीआरआईएसपीआर तकनीक का इस्तेमाल दोनों के लाभों को मिलाने के लिए एक ही सिस्टम में किया जा सकता है।पार्क एट अल।[169] एक छोटे और उच्च सिग्नल-टू-बैकग्राउंड डिटेक्शन के साथ सिंगल-स्टेज आरटी-आरपीए के आधार पर निकाले गए और गर्मी से मारे गए SARS-CoV-2 का पता लगाने के लिए एक वाणिज्यिक माइक्रोफ्लुइडिक चिप में एक CRISPR/Cas12a डिजिटल परख विकसित की गई थी। समय अनुपात।, व्यापक गतिशील रेंज और बेहतर संवेदनशीलता (चित्र। 7d)।इन उदाहरणों के कुछ विवरण तालिका 3 में दिए गए हैं।
न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए विशिष्ट डिजिटल प्लेटफॉर्म।तेजी से डिजिटल पीसीआर वर्कफ़्लो में चार प्रमुख चरण होते हैं: नमूना तैयार करना, प्रतिक्रिया मिश्रण का वितरण, प्रवर्धन प्रक्रिया, और लक्ष्य परिमाणीकरण ([164] से अनुकूलित)।b उच्च घनत्व ([71] से अनुकूलित) पर छोटी बूंद के गठन के लिए स्लिपचिप बूंदों का विश्लेषण दिखा रहा है।c कारमेन-कैस वर्कफ़्लो डायग्राम13 ([158] से अनुकूलित)।d एक बर्तन में CRISPR/Cas के साथ उन्नत डिजिटल वायरस का पता लगाने का अवलोकन ([169] से अनुकूलित)।W/O वाटर-इन-ऑयल, पॉलीडाइमिथाइलसिलोक्सेन PDMS, PCR पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन, DAQ डेटा संग्रह, PID आनुपातिक अभिन्न व्युत्पन्न, मल्टीप्लेक्स न्यूक्लिक एसिड मूल्यांकन के लिए CARMEN कॉम्बीनेटरियल मैट्रिक्स प्रतिक्रिया, SARS-CoV-2, गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम, कोरोनावायरस 2 , पृष्ठभूमि में रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस रीकॉम्बिनेज पोलीमरेज़-आरपीए, एस/बी सिग्नल का आरटी प्रवर्धन